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反相高效液相色谱法测定炎可宁中黄芩苷的含量
作者:李铁纯, 张捷莉, 彭博, 兴东杰, 李学成

《时珍国医国药》 2007年 第2期

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       【关键词】  反相高效液相色谱法;,,炎可宁;,,黄芩苷
       摘要:目的测定炎可宁中有效成分-黄芩苷的含量。方法反相高效液相色谱法:色谱柱为Kromasil  C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.2);检测波长:280 nm;流速:1.0 ml・min-1;柱温:30℃。结果建立了对炎可宁片中黄芩苷进行定量的测定方法,并将此方法用于3个不同厂家生产的炎可宁片中黄芩苷含量的测定。结论   为中药复方提供了更加简便、合理、可靠的质控方法。
       关键词:反相高效液相色谱法;  炎可宁;  黄芩苷
       Determination of Baicalin in Yankening by RP-HPLC
       LI Tiechun, ZHANG Jieli, PENG Bo, XING Dong-jie, LI Xuecheng
       (Anshan Normal University,Anshan 114005,China)
       Abstract:ObjectiveTo determine the bioactive compound"s content of baicalin in Yankening. MethodsRP-HPLC,Kromasil C18 column(4.6 mm×150 mm,5 μm) with methanol-water-phosphoric acid(60∶40∶0.2) as mobile phase. The flow rate was 1ml/min,the column temperature was 30℃and detection was effecive at 280 nm. ResultsThis method was applied to determine baicalin in Yankening produced by different factories successfully. Conclusion This is a more convenient, reasonable and credible quality control method for the Chinese traditional medicine.
       Key words:RP-HPLC;  Yankening;  Baicalin
   
  炎可宁为国家准字号中成药,由黄连、黄柏、板蓝根、大黄、黄芩等5味中药组成,主要用于清热泻火,消炎止痢。作为处方中的主药黄芩性苦寒,具有清热燥湿,泻火解毒,止血安胎的作用[1],所含黄芩苷(结构式见图1)是一种黄酮类化合物,有抗炎、抗菌、解热等作用[2]。以黄芩苷为定量监控指标可有效地控制产品质量。有关黄芩苷的含量测定方法有比色法[3]、分光光度法[4]、薄层扫描法[5]、高效液相色谱法[6]等。在《中国药典》中对炎可宁中黄芩苷含量的测定还没有记载,本文研究了利用反相高效液相色谱法测定了3个不同厂家生产的炎可宁片中黄芩苷的含量。本法具有操作简单、准确、重现性好等优点,同时也为中药复方提供了更加简便、合理、可靠的质控方法。
         1  仪器与试剂
       美国Waters公司高效液相色谱仪(带有Waters 1525液相泵,Waters 2996二极管阵列检测器),超声波清洗器(KQ-250A,昆山市超声波仪器厂),上皿电子天平(FA2004,上海天平仪器厂),TG328B分析天平(上海天平仪器厂),低速离心机(北京医用离心机厂)。
       图1  黄芩苷结构式(略)
       对照品:黄芩苷(中国药品生物制品检定所,供含量测定用)。炎可宁片(市售),甲醇(天津市光复精细化工研究所,色谱纯),无水乙醇(沈阳新兴试剂厂,分析纯),甲醇(沈阳市合富化学试剂经销厂,分析纯)高锰酸钾(丹东市胜利化工厂),二次蒸馏水(自制)。
         2  方法与结果
       2.1  溶液的制备对照品溶液的制备:精密称量干燥至恒重的黄芩苷对照品25 mg置于50 ml容量瓶中,用50%甲醇进行溶解,并超声处理20 min,水浴(50℃)10 min,冷却至室温,再用50%甲醇定容至50 ml,摇匀,即得0.5 mg/ml的黄芩苷贮备液。准确吸取贮备液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0 ml,分别置于10 ml容量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,所得对照品的浓度分别为25,50,100,150,200 μg/ml。样品溶液的制备:精密称取除去糖衣的3个厂家的炎可宁样品,加入甲醇30 ml,超声处理20 min,放置至室温,再用离心机以3 500 r/min的速度离心15 min,取离心液5.0 ml,用甲醇稀释至10 ml,即得样品溶液。
       2.2   色谱和检测条件色谱柱:Kromasil  C18分析柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:甲醇水磷酸(60∶40∶0.2);检测波长:280 nm;流速:1.0 ml・min-1;柱温:30℃;进样体积:10 μl。
       2.3  线性关系的考察在上述条件下,黄芩苷分别在5个浓度点,平行测定3次(均进样10 μl)。以峰面积为纵坐标,对照品浓度(μg/ml)为横坐标,绘制标准曲线如图2所示;回归方程为:C=2.986 9×10-5A+4.088 75, r=0.999 5;黄芩苷在25~200 μg/ml范围内呈良好的线性关系。
       2.4  精密度实验精密吸取黄芩苷对照品溶液,重复进样5次,每次进样体积为10   μl。测定峰面积分别为:5 613 129,5 684 194,5 537 458,5 736 715,5 665 029,5 647 305。RSD为1.3%。
       2.5  回收率试验取已知含量的样品溶液1.0 ml,分别加入对照品溶液1.0 ,1.5,2.0,2.5,3.0 ml,按样品测定法,用上述色谱条件测定,所得结果见表1所示,表明回收率良好,满足定量要求。
       表1  加样回收率实验结果(略)
       2.6  样品中黄芩苷含量测定将样品溶液经0.45 μm滤膜过滤直接进样,分别定量测定黄芩苷的含量。结果见表2。
       表2  3种炎可宁中黄芩苷的含量(略)
       三种样品的色谱图如图2~5所示。
       图2  黄芩苷标准曲线(略)
       图3  样品1的HPLC图(略)
       图4  样品2的HPLC图(略)
       图5  样品3的HPLC图(略)
         3  讨论
       3.1  由于黄芩苷在水和甲醇中的溶解度较小[1],因此配制黄芩苷标液时,其浓度不宜过大,为了加速溶解,最好经超声处理,而且要将样品研细,并要不断振荡。
       3.2  在配制黄芩苷标样的过程中,曾经尝试用不同的溶剂来溶解黄芩苷,分别为甲醇水冰醋酸(47∶53∶0.1),甲醇水磷酸(60∶40∶0.2),甲醇(分析纯),50%甲醇,经过比较,得出由50%甲醇溶解效果最好,由此而得的标准曲线的线性范围最好。
       3.3  流动相:以甲醇水冰醋酸(47∶53∶0.1)和甲醇水磷酸(60∶40∶0.2)进行实验对比,得出甲醇水磷酸(60∶40∶0.2)的分离效果较满意。
       3.4  黄芩是炎可宁的主要成分,所含黄芩苷有抗炎、抗菌、解热等作用。因此以黄芩苷为定量监控指标可有效地控制产品质量。中成药中黄芩苷的测定方法很多,如比色法、分光光度法、薄层扫描法、二阶导数光谱法、高效液相色谱法等。本文利用高效液相色谱法测定炎可宁中黄芩苷的含量,通过线性关系的考察、精密度实验、回收率实验等一系列实验,也证明了高效液相色谱法具有速度快、准确性高、分离效果好等优点,所得结果与炎可宁中黄芩苷实际含量基本一致。
       3.5  《中国药典》中对炎可宁中黄芩苷含量的测定没有记载,有关对中成药炎可宁中黄芩苷含量的测定至今未见报道。用本实验方法测定了不同厂家生产的炎可宁片中黄芩苷的含量,结果也证明了此种方法的简单、快捷、准确,更适合制剂中黄芩苷含量测定。
         参考文献:
       [1]  国家药典委员会.中国药典[S]. 北京:化学工业出版社,2000:248 .
       [2]  季宇琳.中药有效成分药理与应用[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1995:60.
       [3]  张乃吉,王  健,赵岚峰,等.茵栀华工内注射液质量标准的探讨[J].中成药,1991,13(11):11.
       [4]  石淑琴,郭  军.二阶导数法测定双黄连注射液中黄芩苷的含量[J].中成药,1992,14(5):10.
       [5]  胡  斯,张武标,王申东等.薄层扫描法测定复方逍遥散合剂中黄芩苷的含量[J].中成药,2000,22(8):584.
       [6]  何锦丽.HPLC法测定小柴胡胶囊中黄芩苷的含量[J].中成药,2000,22(8):592.
       (鞍山师范学院,辽宁 鞍山  114005)

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