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我国菲牛蛭的研究概况
作者:黎渊弘 黎肇炎    
作者单位:1.广西医科大学第一附属医院,广西 南宁 530021; 2.广西医科大学蛇毒研究所,广西 南宁 530021

《时珍国医国药》 2008年 第11期

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       【摘要】 
       综述了我国菲牛蛭的地理分布、野生资源情况、生态习性和采收季节、化学成分、生物活性成分、药理学作用、分离纯化以及菲水蛭素基因的克隆和序列测定。认为菲牛蛭可作为一种新的药用资源加以研究。
       【关键词】  菲牛蛭 化学成分 药理学作用
       菲牛蛭Poecilobdella  manillensis,俗名金边蚂蟥,别名为马尼拉医蛭,隶属于环节动物门Annelida,蛭纲Hirudinea,无吻蛭目Arhynchobdellida Blanchard,医蛭科Hirudindae Whitman,牛蛭属Poecilobdella Blanchard。牛蛭属已知种有菲牛蛭Poecilobdella  manillensis Lesson 颗粒牛蛭Poecilobdella  granulosa,湖北牛蛭Pecilobdella1 hubeiensis 和Poecilobdella viridis。1968年国外Keegan[1]对东南亚的菲牛蛭生活习惯进行观察。1992年Steiner[2]从产自马尼拉的菲牛蛭中分离纯化新的水蛭素, 测定其原始结构和功能表明有抗凝活性。1993 年Scacheri[3]从菲牛蛭中分离出2 种水蛭素变异体, 测定其氨基酸序列,cDNA 克隆和表达, 表达产物有抗凝活性。2002 年谭恩光等[4]从广东产的菲牛蛭基因组中PCR扩增出水蛭素基因, 并克隆和测序。在此,本文仅对我国菲牛蛭的一些研究进行综述,为开发菲牛蛭资源提供参考。
       1  菲牛蛭地理分布、野生资源情况、生态习性和采收季节
        菲牛蛭主要分布在菲律宾、泰国、越南等东南亚地区及中国的东南、中部和西南部地区。由于有关我国菲牛蛭地理分布、野生资源情况以及生态习性和采收季节相关报道很少,因此,我们对广西区内具有代表性的灵川、象州、岑溪、博白、防城、隆安、田东等15个县(市)的菲牛蛭品种生物学特征、资源数量分布、生态习性和采收季节进行调查,共收集到水蛭样品15份。经外貌与形态特征的初步鉴定,与我国水蛭分类学专家杨潼所描述的菲牛蛭相同,说明区内分布的水蛭以菲牛蛭品种为主。分布在区内各地的菲牛蛭,经体重测定差异不显著,但在数量上桂东南地区明显多于桂西北,钦州、防城野生资源比较丰富,罗城、巴马等地野生资源稀少。数量分布的多寡与温度、雨量、湿度等气候因素有关,符合水蛭喜温、湿、热的特性。通过样品的收集为优化种苗选择提供了丰富的物质基础。
        菲牛蛭生态环境要求和生态习性:根据野外的考察表明,菲牛蛭喜欢在土壤含铁量较高、水体呈弱酸性(pH值5.5~7.0)的环境中繁衍。在野外多发现于荒芜的山塘和山冲田块或湿草地,尤其是土层深厚、土质疏松潮湿,各种水草生长旺盛,并且经常有耕牛、人活动,呈土畦式水体相对固定的环境中多见,常年耕作的田块和已开发养殖的山塘或大面积连体的水体中很少发现。
        菲牛蛭的采收季节:经调查发现,菲牛蛭对温度反应敏感。水温在25~30℃时,活动最活跃,生长最快,也是繁殖的季节。在野外当水温低于15℃时便停止活动,因此,每年的11月前后到次年的4月前后很少发现有菲牛蛭在水中活动,这时它们都进入泥土里越冬,这与其为冷血变温动物,冬季具有冬眠习性相一致。这样菲牛蛭的采收时间宜选择在9~10月份,此时,气温下降,菲牛蛭生长速度减慢,但仍在水中,易于捕捉。
       2  菲牛蛭的化学成分
        2.1  菲牛蛭中脂肪酸分析苗艳丽等[5]对广西产菲牛蛭脂肪酸提取液进行气相色谱/质谱(GC/MS)分析,共分离出19 个峰。与标准谱库对照分析,鉴定了16个组分, 脂肪酸的相对含量采用总离子流各色谱峰面积归一化法定量,结果见表1。实验共鉴定了菲牛蛭中脂肪酸的16个组分,占脂肪酸总量的97. 39 % ,其中饱和脂肪酸占63.34%,不饱和脂肪酸占34.05%。饱和脂肪酸主要有硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等;不饱和脂肪酸主要包括油酸、11 - 二十碳烯酸等。其中含量最多的是十六烷酸,达到23.78%,其次是9 - 十八碳烯酸,含量为12.53%;11 - 二十碳烯酸含量为11.75%。菲牛蛭中所含的单不饱和脂肪酸,如9 - 十八碳烯酸和11 - 二十碳烯酸的含量高于中药蚂蟥中的含量[6]。
        表1  菲牛蛭中脂肪酸的组成及含量
        序号脂肪酸 分子式(甲脂)相对含量( % )13 - 甲基十三酸C15H30O21. 022十四酸(肉豆蔻酸) C15H30O22.8834, 8, 12 - 三甲十三酸C17H34O27. 434十四酸(异构体)C15H34O20. 655十五酸C16H32O21. 48614 - 甲基十五酸C17H34O2 1.279 - 十六烯酸C17H32O23. 968十六酸(棕榈酸) C17H34O2 23.78915 - 甲基- 十六酸C18H36O26.091014 - 甲基- 十六酸C18H36O23.6511十七酸 C18H36O22.78123,7,11,15 - 四甲基十六酸 C21H42O21.77139 - 十八烯酸C19H36O212. 53148 - 十八烯酸C19H36O25. 8115十八酸(硬脂酸)C19H38O210.611611 - 二十烯酸C21H40O211.75
        2.2  菲牛蛭中氨基酸的分析苗艳丽等[5]采用HPLC法,测定广西产菲牛蛭提取液中的氨基酸。并采用内标法进行含量测定,结果见表2。测定结果表明菲牛蛭中含有18种氨基酸,甘氨酸的含量最高为5 392.70 μg/g,其次是亮氨酸含量为2 340.59 μg/g。其中含有人体必需的7种氨基酸,这7种必需氨基酸含量为5 536.28 μg/g,占氨基酸总量的28.16%;高于其他水蛭(日本医蛭为22.50%,蚂蟥为21. 40%)[7]中必需氨基酸的含量。
        表2  菲牛蛭中氨基酸的组成及含量μg·g-1
        氨基酸含量氨基酸含量△天门冬氨酸2 142.24胱氨酸687.72谷氨酸205.65* 缬氨酸 512.65丝氨酸606. 21* 蛋氨酸213.35组氨酸398. 94色氨酸320.26△甘氨酸 5 392. 70* 苯丙氨酸383.02* 苏氨酸520. 21* 异亮氨酸 1401.29△丙氨酸1 478. 56赖氨酸899. 29△精氨酸 1 637. 35△* 亮氨酸2 340.59* 酪氨酸165. 17脯氨酸353.74
        *为人体必需氨基酸;△:为含量较高的氨基酸
       3  菲牛蛭的生物活性成分及其药理学作用
        3.1  菲牛蛭素(Bufrudin)[8]菲牛蛭素是从菲牛蛭分出的一种多肽,由60多个氨基酸组成,分子量7 000 D,序列分析表明,其中50%~60%的氨基酸残基与水蛭素相同。其立体结构和构型有待进一步研究。它的作用机理与水蛭素(Hirudin)、森林山蛭素(Haemadin) 相同,都是抑制凝血酶[9]。
        黄爱民等[10]从广西产菲牛蛭消化液中分离出两种特异凝血酶抑制剂-菲牛蛭素A(Bufrudin A ,BDA)、菲牛蛭素B(Bufrudin B ,BDB)。BDA分子量约为15.2KD,等电点为3.97;BDB分子量为14.6 KD,等电点为4.61。紫外扫描发现,BDA在230 nm处有最大吸收,而BDB的最大吸收则在200~210 nm之间。每1 000 ml水蛭消化液可以分离出菲牛蛭素A 630 μg, 菲牛蛭素B 615 μg,收率菲牛蛭素A约为0.303%; 菲牛蛭素B约为0.300%。
        3.1.1  菲牛蛭及活性成分的抗凝血作用黄爱民等[11]用广西菲牛蛭中提取的两种菲牛蛭素(菲牛蛭素A和B)在体外及动物体内进行抗凝血实验,结果表明:菲牛蛭素A和B均能明显延长活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)及凝血酶时间(TT),但两者的3个指标有明显差异性,其中菲牛蛭素A对凝血酶时间(TT)的作用最显著,菲牛蛭素B则凝血酶原时间(PT)的作用更强。对于凝血因子,菲牛蛭素A对Ⅱ,Ⅷ,Ⅻ因子产生抑制作用,对Ⅴ,Ⅸ,Ⅹ,Ⅺ因子无影响;菲牛蛭素B则对Ⅱ,Ⅷ,Ⅹ,Ⅻ因子产生抑制作用,对Ⅴ,Ⅸ,Ⅺ因子无影响。广西菲牛蛭中的抗凝物质BDA、BDB均有很强的抗凝活性。
        此外,李文等[12]用7种水蛭进行全血与血浆复钙时间试验,证实日本医蛭与菲牛蛭都表现了强大的抗凝血作用(样品在10 min测试时间内不凝)。湖北牛蛭的抗凝效果也十分突出。
        3.1.2  菲牛蛭及活性成分的抗血栓作用吴志军等[13]采用大鼠静脉血栓模型,研究了菲牛蛭制品的抗血栓与溶血栓作用。结果表明,阳性药脑血康和4种不同物种的水蛭冻干粉样品具有明显的抗血栓作用,各物种抗血栓作用强度依次为菲牛蛭冻干粉>日本医蛭冻干粉>欧洲医蛭冻干粉>宽体金线蛭冻干粉;同等剂量的菲牛蛭全身冻干粉样品和阳性药脑血康具有相当的抗血栓与溶血栓作用,而菲牛蛭头部段冻干粉则比前两者溶血栓效果更佳。
        黎渊弘等[14]用广西菲牛蛭提取物对家兔体外血栓、动脉血栓及大鼠静脉血栓进行抗血栓研究,结果表明,大(1.5 ATU),中(0.75 ATU),小(0.5 ATU)剂量组与对照组相比,菲牛蛭提取物对家兔体外血栓形成有显著性差异(P< 0.05),血栓抑制率为24.3%~100%。与对照组比较,给药组药后10,15 min对大鼠半体内血栓形成影响有显著性差异(P<0.05),血栓的湿重明显减小或完全消失。大鼠静注菲牛蛭提取物60 ATU/kg后,大鼠静脉血栓形成率为0,血栓干湿重为0,与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01)。家兔静注菲牛蛭提取物60 ATU/kg前和给药后15,30,45 min,家兔动脉血栓干湿重有显著性差异(P<0.05),药物作用时间为1 h。
        3.2  纤维蛋白溶解酶    笔者采用纤维蛋白平板法[15]定性测定广西产菲牛蛭唾液提取液纤维蛋白溶解酶。结果表明:在标准平板和加热平板上加入广西产菲牛蛭唾液提取液20 μl后,溶圈直径为0.6 cm,表明能溶解纤维蛋白。而尿激酶20 μl在标准平板上有较强的纤溶作用(溶圈直径为1.3 cm),在加热平板上无纤溶作用(溶圈直径为0)。说明菲牛蛭唾液提取液的纤溶机制与尿激酶不同,是以直接纤溶为主。菲牛蛭唾液提取液经过10%~100%硫酸铵处理,部分蛋白被沉淀,由于硫酸铵的量不同,溶圈大小也不同。10%硫酸铵处理样品上清液的溶圈直径最大,80%硫酸铵处理样品上清液的溶圈直径最小。
        3.3  抗血小板聚集活性成分  李文等[12]从7种水蛭对抗ADP或胶原诱导的血小板聚集的结果表明:日本医蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表现了抗血小板聚集的作用。其中以日本医蛭的效果最佳。在3.08 mg/ml浓度下已表现抑制ADP诱导聚集的作用;其次为菲牛蛭,在9.23 mg/ml时对血小板最大聚集率(PAm,%) 和1 min时血小板聚集率(Par,%) 都表现了显著抑制;湖北牛蛭的抑制ADP诱导血小板聚集作用则需要较高浓度。笔者也发现,25 μl广西产菲牛蛭唾液提取液对ADP诱导的聚集表现90%的抑制。
        3.4  抑菌活性成分  广西菲牛蛭唾液粗提液未发现抑菌活性,但是经过离心处理,对金色葡萄球菌有抑制作用,抑菌圈直径为1.0 cm。可能是因为粗样中成分多而杂,进行抑菌检测时干扰大,而导致阴性结果。经过离心,干扰蛋白被沉淀分离,显示阳性结果。
       4  菲牛蛭粗品和菲牛蛭素精品的制备[11]
        4.1  提取粗品先配制提取液,然后让菲牛蛭吸吮,待菲牛蛭充分吸饱后,再将其挤压,收集唾液(水蛭素粗品),每隔3周可提取1次,每条可以反复提取5~6次,最后还可将整体冻干后粉碎作最后的提取。
        4.2  广西菲牛蛭素精品的分离纯化
        4.2.1  广西菲牛蛭素的粗提取广西菲牛蛭唾液提取液1 000 ml,用三氯醋酸进行酸沉;4℃,8 000 r/min 离心30 min,弃沉淀,取上清液65~70℃保温30 min,适当搅拌;调pH值至中性,4℃,8 000 r/min离心10 min,弃沉淀,保留上清液。
        4.2.2   广西菲牛蛭素的提取纯化
        4.2.2.1  DEAE-纤维素柱层析选用的层析柱长为30 cm,直径2.6 cm。将上清液加到已用0.02 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 5.5)平衡的DEAE-纤维素柱上,以0~1 mol·L-1 NaCl 1 000 ml进行线性梯度洗脱,流速为1 ml·min-1,以每管10 ml收集各蛋白峰,按Markwardt凝血酶滴定法测定各管蛋白峰的活性,收集具有抗凝活性的A1峰及B1峰。
        4.2.2.2  Sephadex G-50 凝胶过滤柱层析选用的层析柱柱长为100 cm,直径1.6 cm。取浓缩后的DEAE-纤维素柱的A1峰和B1峰,分离上样于已用0.02 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH5.5)平衡的Sephadex G-50柱上,用相同缓冲液洗脱,流速为0.3 ml·min-1,每管10 ml收集蛋白峰,同法测定各蛋白峰的抗凝活性,分别收集具有抗凝活性的A2,B2峰。
        4.2.2.3  反相HPLC进一步纯化采用Waters 2487 Dual λAbsorbance Detector ,Waters 600 controller ,WatersTM600 Pump. 在UV210 nm下,选用制备型ULTRASPHERE ODS C18柱(10 mm×25 cm),将DEAE-纤维素柱洗脱的活性峰成分A2,B2透析浓缩后分别进样。用0.1%TFA水溶液充分平衡后,以30 min 0~60%的乙腈(含0.1% TFA)线性梯度洗脱,流速为3 ml·min-1)洗脱,分别收集抗凝活性峰A3,B3,冻干后即得具有抗凝活性的物质BDA,BDB。
       5  菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定
        谭恩光等[4]以我国广东菲牛蛭为材料,研究地理因素对菲牛蛭水蛭素基因结构变异的影响。研究表明:广东菲牛蛭水蛭素基因(Hmg)全长642 bp,与马尼拉的菲牛蛭水蛭素基因Hm1 和Hm2同源性分别为9O%和88.6% 。从整个多肽链看来,广东菲牛蛭水蛭素基因序列,也具有如下特征:①Hmg的N端第6,13,15,21,27和36位为半胱氨酸,推测这6个半胱氨酸将形成3对二硫键,对分子构型起稳定作用;②Hmg亦含1个富酸性羧基末端片段。此片段中有7个酸性氨基酸,为分别位于50、54、55、59的谷氨酸和位于52,58,60的天冬氨酸。酸性羧基末端片段与凝血酶的识别部位结合,即带负电的羧基末端氨基酸残基和凝血酶分子结构中带正电氨基酸形成的凹槽 离子键相互作用是复合物形成关键一步,也是发挥功能的重要一步;③ 肽链中部还有一个由Prc-Lys44——Pro组成的特殊序列,此3个残基与凝血酶活性部位裂缝相互作用,抑制了此酶的功能[16~18]。此外广东菲牛蛭水蛭素羧基端不存在来自医蛭素中的磺酸化修饰的Tyr,代之是He,这表明水蛭不同科之间,蛭素基因的翻译后修饰进化方式不同。
       6  菲牛蛭中有害物质含量和急性毒性
        吴志军等[13]测定了菲牛蛭中有害物质含量和急性毒性试验。结果表明:3批不同批号菲牛蛭样品中铜、铬、砷、汞、铅 5种有害重金属元素含量总和< 20 mg/kg,砷元素含量< 2 mkg,有机氯类和有机磷类农药残留量均很低。急性毒性:LD >10 g/kg。菲牛蛭中重金属含量和有机氯以及有机磷农药残留量均符合国家有关要求,菲牛蛭可考虑作为一种新的药用资源加以研究。
        我国有水蛭近百种,但《中国药典》(1995年版)只收载3种,而市场上出售的水蛭药材实际只有宽体金线蛭一种。笔者认为,对其它品种的水蛭尤其是吸血水蛭例如菲牛蛭等,有必要进行多学科的综合研究,以扩大入药水蛭的品种,造福于人类。
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