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黄芪皂苷和黄芪多糖对大鼠肾脏系膜细胞增殖的影响
作者:房信胜, 穆象山, 周红英, 王建华, 谭晓梅    
作者单位:1.山东农业大学农学院,山东 泰安 271018;2.山东省泰安市中医医院 271000;3.南方医科大学,广东 广州 510515

《时珍国医国药》 2008年 第6期

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       【摘要】 
       目的观察黄芪皂苷和黄芪多糖对体外培养的肾脏系膜细胞增殖的影响。方法分离和培养大鼠肾脏系膜细胞,用MTT法研究不同浓度的皂苷和多糖对细胞增殖的影响,并计算抑制率。结果黄芪多糖在低浓度时表现出一定的促进细胞增殖作用,在高浓度时有一定的抑制作用;黄芪皂苷在所考察的范围内均表现出一定的抑制作用。结论黄芪皂苷和黄芪多糖在一定浓度时对肾脏系膜细胞增殖具有一定的抑制作用,为其在治疗肾小球肾炎中的作用提供了理论依据。
       【关键词】  黄芪皂苷 黄芪多糖 肾脏系膜细胞 增殖
       Effect of Astragalosides and Astragalus Polysaccharide on the Proliferation of Glomeruli Mesangial Cells
       FANG Xinsheng, MU Xiangshan,ZHOU Hongying,WANG Jianhua,TAN Xiaomei
       1. Agricultural College in Shandong Agricultural University, Taian 271018, China;
       2. Key Laboratory of Pharmaceutics of Chinese Materia Medica, Nanfang Medical University,  Guangzhou  510515, China;
       3.Traditional Chinese Medicine Hospital in Taian City ,Taian 271000,China
       Abstract:ObjectiveTo study the effect of Astragalosides and Astragalus Polysaccharide on the proliferation of glomeruli mesangial cells(GMCs). MethodsExtract and culture GMCs from SD rats,then study the effect of different density of Astragalosides and Astragalus Polysaccharide on the proliferation of GMCs by MTT assay, and calculate the inhibitory rate. ResultsAstragalus Polysaccharide could stimulate the cells to reproduce in low density, and had inhibitory activity in high density. Astragalosides show some inhibitory activity in the density investigated. Conclusion Astragalosides and Astragalus Polysaccharide can inhibit proliferation of GMCs.
       Key words:Astragalosides;  Astragalus Polysaccharide;  Glomeruli mesangial cells;  Proliferation
       慢性肾炎在现代医学中治疗困难,而中医根据辨证论治表现出了一定优势。在中医应用处方中,黄芪使用频率很高,并且临床和实验研究都表明黄芪疗效确切,具有多方面的药理作用。现代研究表明,肾脏系膜细胞(GMsC)是肾小球肾炎发生发展过程中的主要靶细胞[1,2],是肾小球肾炎发生、发展及肾小球硬化的重要病理基础[3,4],因此抑制系膜细胞增生是治疗该类疾病的重要途径。本实验用体外培养的肾脏系膜细胞,研究黄芪皂苷和多糖是否通过抑制肾脏系膜细胞增殖而对肾炎起到治疗作用。
       1  器材
       1.1  试剂 
       胎牛血清(杭州四季青公司),RPMI1640营养液,IV型胶原酶,胰蛋白酶(均为 Gibco 公司产品),结蛋白、肌动蛋白和角蛋白, 噻唑蓝(MTT),二甲基亚砜(均为Sigma 公司产品),胰岛素(江苏万邦医药公司)。
       1.2  仪器 
       96孔培养板(Corning Incorporated);CO2培养箱 (Kendro Laboratory Products);倒置显微镜 (Olympus Japan);超净工作台(苏净集团安泰公司);酶标仪(BIO-RAD,USA)。
       1.3   动物 
       SD大鼠,雄性,150~180 g。
       1.4  药物 
       黄芪皂苷,黄芪多糖,实验室自制,比色法测定含量,均为80%以上。
       1.5  试剂及药物配制
       1.5.1  Ⅰ号溶液RPMI1640营养液+L-谷氨酰胺(30 mg·ml-1)+丙酮酸钠(2 mmol·L-1)+HEPES液(15 mmol·L-1)+青霉素、链霉素(各100 U·L-1),用0.22 μm微孔滤膜滤过备用。
       1.5.2  Ⅱ号溶液(培养液)在Ⅰ号溶液中加入灭活胎牛血清使含量达20%;加入胰岛素使含量达0.66 U·ml-1。
       1.5.3  酶胰蛋白酶:用RPMI1640营养液配成0.25%的溶液备用;IV型胶原酶:用RPMI1640营养液配成1 000 U·ml-1的溶液备用。
       1.5.4  药物溶液配制取黄芪皂苷和黄芪多糖适量,分别用RPMI1640营养液溶解,0.45 μm微孔滤膜滤过,适当稀释后均配成1,10,100,500,1 000 μg·ml-1的溶液,用前过0.22 μm微孔滤膜除菌。
       2  方法与结果
       2.1  肾脏系膜细胞的分离、培养和鉴定[5,6]SD大鼠6只,乙醚麻醉后无菌操作取出双肾,拨去肾膜,分离出肾皮质,用剪刀剪成约1 mm3的小块,用PBS 洗液洗至无血球,再移至150目和220目重叠的筛网上,在150目筛上轻轻研磨,并不时用PBS冲洗,收集220 目筛面上的肾小球。将含PBS的悬液倒入离心管,800 r/min离心10 min,弃去PBS,用I号液洗肾小球1次,离心,弃去上清。加入1 000 U·ml-1的IV型胶原酶4 ml于37℃水浴中消化20~30 min,期间时时振摇。消化后组织呈分散状,镜下观察,肾小球多单个散在。
       
       经镜下观察计数,以肾小球密度为1.5×105个/ml将悬液加入到25 cm2的培养瓶中,每瓶加入5 mlⅡ号培养液,放入培养箱,37℃,5% CO2 培养。约70%以上肾小球贴壁时,更换培养液继续培养。当细胞长满瓶底时,用0.25%胰蛋白酶消化,进行传代培养。
       
       经形态学观察和免疫组化法鉴定。结果:倒置显微镜下,细胞纤维状,梭型或不规则星型,有的中央可见卵圆型核;结蛋白和肌动蛋白检验呈阳性,而角蛋白检验呈阴性。
       2.2  药物对GMsC增殖的影响取培养至3~7代的细胞用于实验。以8×104个/ml 的细胞密度接种于96孔培养板,每孔150 μl,放入培养箱培养24 h。将各孔培养液吸出,按顺序加入含不同浓度药物的培养液150 μl(血清浓度10%),以不加药物的细胞作为空白对照,每个浓度平行加6个孔,每种药物设5个浓度,分别为1,10,100,500,1 000 μg·ml-1,对照组只加培养液。培养板放入培养箱培养48 h。然后每孔加入5 mg·ml-1的MTT 20 μl,放入培养箱培养4 h,弃去上清,吸干,每孔加入DMSO 150 μl,轻轻摇匀,放入培养箱反应15 min,于酶标仪570 nm处检测,记录各孔的吸收度。对数据进行分析,并计算不同浓度药物对细胞增殖的抑制率。结果见表1~2,以抑制率为纵坐标,以给药浓度为横坐标绘制抑制率曲线。结果见图1。  表1  不同药物浓度的吸收度均值(略)表2  不同药物浓度对GMsC增殖的抑制率(略)
       
       抑制率(%)=(空白组吸收度-药物组吸收度)空白组吸收度×100%
       3  讨论
       在系膜增生性肾小球肾炎中,系膜细胞增殖是重要的病理特征。研究表明,肾脏系膜细胞是肾小球肾炎发生发展过程中的主要靶细胞,其异常增生是肾小球肾炎发生、发展及肾小球硬化的重要病理基础。临床研究和实践证明,黄芪是中医治疗肾炎的重要药物,对降低蛋白尿疗效显著,文献报道较多的是黄芪注射液的治疗作用和作用机理。黄芪皂苷和黄芪多糖是黄芪中主要的有效部位,研究表明,黄芪皂苷和多糖对治疗肾小球肾炎具有一定的药理活性[7~10]。本实验是在制备了具有一定质量标准的中药有效部位的前提下,研究黄芪皂苷和多糖对体外培养的肾脏系膜细胞增殖的抑制作用,考察其治疗肾炎的作用机理。从结果看,黄芪多糖在低浓度时表现出一定的促进细胞增殖作用,在高浓度时才表现出一定的抑制作用,而黄芪皂苷在所考察的浓度范围均表现出一定的抑制作用,且具有一定的量-效关系。本研究也表明,有些中药或其有效部位会因给药浓度的不同而产生不同的药效,因此在应用中必须掌握药物的浓度。在以后的研究中将进一步考察两类成分对体内外肾脏系膜细胞的影响以及其量-效关系,从而阐明黄芪治疗系膜增生性肾炎的物质基础和一些作用机理,也为相关药物研究奠定了基础。
       【参考文献】
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       [3]戴京璋.实用中医肾病学,第1版[M].北京:人民卫生出版社,2002:152.
       
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