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贞灵固本片中黄芪甲苷的固相萃取-高效液相色谱-蒸发光散射测定
作者:窦玉红,崔力剑,黄芸,李清    
作者单位:1. 河北医科大学中医学院,河北 石家庄 050091; 2. 河北医科大学药学院,河北 石家庄 050017

《时珍国医国药》 2009年 第12期

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       【摘要】 
       目的建立贞灵固本片中黄芪甲苷的含量测定方法。方法采用固相萃取-高效液相色谱-蒸发光散射检测法(SPE-HPLC-ELSD),Agilent-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),流动相甲醇-水(74∶26),柱温35℃ ,流速0.8 ml·min-1。结果黄芪甲苷在0.272~5.432 μg范围内具有良好的线性关系,r=0.999 9;平均加样回收率为98.82%,RSD为1.57%(n=9)。结论该方法简便、快速、灵敏、准确、重复性好,可作为贞灵固本片的质量控制方法。
       【关键词】  贞灵固本片; 固相萃取; 高效液相色谱; 黄芪甲苷
       Determination of Astragaloside Ⅳ in Zhenlingguben Tablets by SPE-HPLC-ELSD
       DOU Yuhong1, CUI Lijian1, HUANG Yun2*, LI Qing1
       1. Traditional Chinese Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050091,China; 2.School of Pharmacological Science, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017,China
       Abstract:ObjectiveTo build up a method for determination of astragaloside Ⅳ in Zhenlingguben tablets. MethodsSPE-HPLC-ELSD was used in the quantitative analysis with Agilent C18 chromatography column (4.6 mm×250 mm, 5μm) and methanol-water (74∶26) as a mobile phase. The flow rate of mobile phase was 0.8 ml·min-1. The column temperature was set to 35℃.ResultsThe linear range for astragaloside Ⅳ was 0.272~5.432μg (r=0.999 9), the average recovery was 98.82% (RSD=1.57%, n=9).ConclusionThis method is simple, rapid, reproducible, and can be regarded as the quality control method of Zhenlingguben tablets.
       Key words:Zhenlingguben Tablets;   Solid-phase extraction;   HPLC;   Astragaloside Ⅳ
        贞灵固本片是我校正在研制上报的新药,主要由女贞子、灵芝、黄芪等中药加工而成,具有益气解毒、散结消肿、和胃安神功效,用于肿瘤放化疗引起的白细胞下降,血小板减少,亦可用于免疫功能降低所致的体虚乏力、食欲不振、呕吐、失眠等症的辅助治疗。其主要成分黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)具有镇痛、镇静和降血压等药理活性,样品中杂质对黄芪甲苷定量分析干扰较大。文献报道[1~4]多用水饱和正丁醇萃取HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量,该方法过程较复杂,溶剂用量多,实验中易造成黄芪甲苷的损失,测定结果偏低。本文采用固相萃取结合高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量。
       1  仪器和试药
       1.1  仪器
       Agilent 1100高效液相色谱系统(美国Agilent 公司),Alltech500型ELSD系统(美国Alltech公司)和WYK-2无烟无油空压器 (天津市蓝珂科技实业公司)。Agilent HC-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm); C18固相萃取柱(美国Bestown公司);电子天平BS223S(德国Sartorius公司)。
       1.2 药品
       贞灵固本片(河北医科大学提供,规格:每片0.26g复方提取物,批号:20060511,20060518,20060528);黄芪甲苷对照品(批号:110781-200210)购自中国药品生物制品检定所。
       2  方法与结果
       2.1   溶液的配制
       2.1.1  对照品溶液精密称取黄芪甲苷对照品2 mg,置10 ml容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得浓度为200 μg/ml的对照品溶液。
       2.1.2  供试品溶液精密称取贞灵固本片细粉约4 g,置具塞三角瓶中,精密加入60%甲醇25 ml,称重,超声提取,用60%甲醇补足重量,4 000 r/min离心15 min,吸取上清液20 ml,加1%NaOH 1 ml,摇匀,4 000 r/min离心15min,洗涤沉淀,合并上清液上固相萃取小柱(已活化),先用3 ml水洗涤,然后甲醇洗脱,定容至5 ml,过0.45 μm微孔滤膜,作为供试品溶液[5]。
       2.1.3  阴性对照液除去黄芪药材,按处方量比例取各组分,制成黄芪阴性样品,按供试品溶液配置方法制得阴性对照液。
       2.2  色谱条件 
       色谱柱为Agilent- C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为甲醇-水(74∶26);蒸发光散射检测器;流速0.8 ml/min;漂移管温度95℃;空气流速3 ml/min;柱温30~40℃。
        取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液进样测定,色谱图见图1。从图l可见,黄芪甲苷的保留时间约为12 min,且与相邻色谱峰分离效果好(分离度2.45),柱效按黄芪甲苷计不低于5 000。
       2.3   线性关系的考察 
       精密吸取对照品溶液(0.271 6 mg/ml)1,2,5,10,20 μl,进样,测定峰面积,以峰面积 (Y)对进样量(X)分别取对数后,进行线性回归,回归方程为:LnY = 1.702 6 LnX - 4.642 5,表明黄芪甲苷在0.272~5.432 μg范围内呈良好线性关系(r=0.999 9)。
       2.4    精密度实验
       吸取对照品溶液及供试品溶液,各进样6次,5 μl/次,测定峰面积,检测结果对照品的RSD值为0.67%(n=6),样品的RSD值为0.81%(n=6),表明仪器的精密度良好。
       2.5    稳定性实验取对照品溶液及供试品溶液,在0,2,4,8,12,24 h内每隔一定时间进样,5 μl/次,记录峰面积,RSD值分别为1.47%(n=6)和1.21%(n=6)。检测结果表明在24 h内,对照品和样品的峰面积稳定。
       2.6   重复性实验同一批贞灵固本片,分别取样品6份,每份3 g,精密称定,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.8”项下方法测定计算含量。黄芪甲苷的平均含量为0.729 8 mg/g,RSD为1.92% (n=6),表明方法的精密度良好。
       2.7  加样回收实验精密称取已知黄芪甲苷含量的3批样品细粉,各3份,分别精密加入对照品溶液0.8,1.0,1.2 ml。按“2.1.2”项下方法制备回收率实验用供试品溶液。测定含量,计算回收率为98.82%,RSD为1.57%。
       2.8   样品的测定 
       按供试品溶液制备项下方法分别制得3批供试品溶液,分别精密吸取供试品溶液5 μl,依次进样,测定。每批次供试品溶液测定3次,按测得的峰面积积分值取平均值,计算含量。结果见表1。表1  样品中黄芪甲苷含量测定结果(略)
       3  讨论
        在本实验过程中首先考察上样溶液及洗脱溶液的甲醇浓度。绘制黄芪甲苷的洗脱曲线,结果甲醇浓度在60%以下,洗脱液中无黄芪甲苷,纯甲醇洗脱,黄芪甲苷回收率为103.2%,故上样溶剂定为60%甲醇,用纯甲醇作为洗脱溶剂。为简化实验过程,在不影响提取效果的前提下,用60%甲醇作为提取溶剂。
       
       《中国药典》及较多文献采用氨试液去除黄芪甲苷样品液中的酸性成分。作者参考文献[6] ,对氨试液及1%NaOH溶液的去杂效果进行了比较,色谱分析结果表明,1%NaOH溶液洗涤效果较氨试液好,能更好地去除样品中黄酮等含酚羟基的酸性杂质。
        从固相萃取与水饱和正丁醇萃取法这两种方法测得贞灵固本片中黄芪甲苷的含量来看,前者测得含量为0.727 1 mg/g,后者为0.541 3 mg/g。说明采用固相萃取方法测得的黄芪甲苷量比水饱和正丁醇萃取法要高,处理过程中黄芪甲苷损失较少,可提高含量测定的准确性。
       
       本实验采用蒸发光散色检测技术对样品中所含的黄芪甲苷进行了分析。因为黄芪甲苷在紫外吸收在末端吸收位置[7] ,所设计的实验方法避免了紫外末端吸收波长造成的基线漂移等因素,提高了检测的灵敏度。我们对比了超声、冷浸、热回流等提取方法及提取时间对样品的提取率的影响,结果表明超声处理30 min效果最佳。实验表明,黄芪甲苷样品经固相萃取处理,HPLC分析结果具有较好的准确性和重复性,SPE-HPLC可作为黄芪或其它黄芪制剂中黄芪甲苷的含量分析方法。
       【参考文献】
           [1]吴玉强,罗轶. HPLC-ELSD法测定复方扶芳藤合剂中黄芪甲苷[J]. 中草药, 2006,37(9): 1353.
       
       [2]徐希科,李慧梁,柳润辉. HPLC-ELSD法测定黄芪药材中黄芪甲苷[J]. 中草药, 2005,36(11): 1720.
       
       [3] 韩淑萍,孙建宇. HPLC-ELSD测定补气口服液中黄芪甲苷含量的方法研究[J]. 中成药, 2006,28(12): 1858.
       
       [4]倪春生,张裕民,邓满梅. HPLC-ELSD测定龙琥醒脑颗粒中黄芪甲苷的含量研究[J]. 中医药导报, 2007,13(5): 89.
       
       [5]陈蕾,李永庆,朱霁虹. SPE-HPLC法测定菊延保康颗粒中延胡索乙素的含量[J]. 中成药, 2003,25(8): 629.
       
       [6]周春玲,鲁静.高效液相色谱蒸发光散射检测测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].中国中药杂志,2000,25(3):166.
       
       [7]陈国广,陈振华,刘伯成. 黄芪甲苷-羟丙基-β-环糊精包合物的制备[J]. 中国医药工业杂志,2007,38(1): 30.

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