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高效液相色谱法测定欧亚旋覆花中绿原酸的含量
作者:耿红梅    
作者单位:(衡水学院, 河北 衡水 053000)

《时珍国医国药》 2009年 第1期

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       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱(HPLC)法测定欧亚旋覆花中绿原酸的含量。方法采用色谱柱为Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液(10∶90);流速为1.0 ml/min;检测波长为326nm。结果绿原酸在0.20~8.0 μg范围内线性关系良好(r=0.999 6),回归方程为Y=5 342.2X+1 960.5。平均回收率为100.42%,RSD为1.9%。结论该法简便、准确,重现性好,可用于测定欧亚旋覆花中绿原酸的含量。
       【关键词】  绿原酸; 欧亚旋覆花; 高效液相色谱法
       欧亚旋覆花为菊科植物欧亚旋覆花Inula britannica L.的干燥头状花序,性味苦、辛、咸、微温,归肺、脾、胃、大肠经,具有降气、消痰、行水、止呕的功效,常用于风寒咳嗽,痰饮蓄结,胸膈痞满,喘咳痰多,呕吐噫气,心下痞硬[1]。文献报道欧亚旋覆花所含主要化学成分有黄酮类化合物[2~4]、萜类[5,6]、挥发油[7]、多糖[8]以及酸类化合物等,具有抗炎镇痛、抗肿瘤和抗氧化等[9]活性。绿原酸具有抗菌消炎作用,是欧亚旋覆花的有效成分之一。在2005版《中国药典》中无含量测定项。为了有效控制药材质量,我们用HPLC法测定了7个不同产地欧亚旋覆花中绿原酸的含量。现报道如下。
       1  仪器与材料
       
       Agilent 1100 series 高效液相色谱仪(G1310A 四元泵,G1313A自动进样器,G1316A柱温箱,G1314A紫外检测器);GR-202型电子分析天平(A&D Company);KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
       
       乙腈为一级色谱纯(美国), 水为重蒸水并经0.45μm滤膜过滤,其它试剂均为分析纯。绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所,批号为110753-200212;实验药材分别采购于山西、甘肃、江苏、河南、安国等地,经河北医科大学生药教研室聂风禔教授鉴定为菊科植物欧亚旋覆花。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件 Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液(10∶90);柱温30℃;检测波长326 nm;流速1.0 ml/min;进样量20 μl;在该色谱条件下,样品中绿原酸峰与其它非被测成分峰能够达到基线分离,对照品与样品的色谱图见图1。
       2.2  对照品溶液的制备  精密称取干燥的绿原酸对照品约10 mg,置100 ml棕色容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每毫升含绿原酸0.1 mg,10℃以下保存)。
       2.3  供试品溶液的制备  将60℃减压干燥5 h的花粉碎,取粉末约0.5 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入50%甲醇20 ml,密塞,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。
       2.4  线性关系考察  配制绿原酸对照品溶液浓度为0.40 mg/ml,稀释,使绿原酸的浓度分别为0.20,0.10,0.05,0.02,0.01 mg/ml,进样各20 μl,按拟定色谱条件测定,记录峰面积值。以峰面积Y值为纵坐标,进样量X为横坐标进行线性回归,得回归方程为Y=5 342.2X + 1 960.5,r=0.999 6。结果表明绿原酸进样量在0.20~8.0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
       2.5  稳定性实验 准确称取同一批欧亚旋覆花,按“2.3”项下方法制备成供试品溶液,并分别于0,4,8,12,18,24 h测定绿原酸峰面积,结果RSD为1.3%,表明样品在24 h内具有良好的稳定性。
       图1  绿原酸对照品色谱图(略)
       图2  欧亚旋覆花供试品色谱图(略)
       2.6  精密度实验 精密吸取对照品溶液20μl,连续进样5次,测定峰面积,RSD为0.2%,表明仪器精密度良好。
       2.7  重复性实验精密称取同一批欧亚旋覆花药材共5份,约0.5 g/份,照“2.3”项下制备供试品溶液测定,测得其平均含量为1.52 mg/g ,RSD为1.8%,表明方法重复性良好。
       2.8  加样回收率实验 准确称取同一批欧亚旋覆花药材5份,约0.5 g/份,照“2.3”项下制备供试品溶液,测定,计算回收率。结果见表1。
       表1  欧亚旋覆花中绿原酸加样回收实验结果(略)
       2.9  样品含量测定  取7个不同产地的欧亚旋覆花,按“2.3”项下方法制备成供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件进样测定,计算含量。结果见表2。
       表2  欧亚旋覆花中绿原酸的含量测定结果(略)
       3  讨论
       
       结果表明,不同产地的欧亚旋覆花的绿原酸含量相差较大,最高的为1.52 mg/g,最低的为0.46 mg/g ,说明欧亚旋覆花中绿原酸的含量受产地、环境、气候和采集时间的影响较大。
       
       绿原酸对光较敏感,长时间光照易分解,因而实验中绿原酸对照品与样品均应采用棕色量瓶放置,保存10℃以下。稀释液不易长期保存,最好现用现配。
       
       本实验考察了不同提取方法(热回流、超声波震荡)、不同提取溶剂(50%甲醇、80%甲醇,甲醇,水)、不同提取时间(20,30,40 min),结果表明,50%甲醇超声处理30 mim提取效率最高。
       
       绿原酸高效液相色谱法测定波长有327,330,325 nm等报道[10]。将绿原酸对照品溶液、供试品溶液分别注入液相色谱仪中,以二极管阵列检测器进行测定,得到它们的色谱扫描图及光谱吸收曲线。绿原酸对照品、欧亚旋覆花供试品所含绿原酸的光谱吸收曲线相一致,均在326 nm左右有最大吸收,故确定326nm为检测波长,供试品与绿原酸对照品在相应位置上有相似的吸收峰且分离度良好。
       
       本实验方法简便准确,为药材欧亚旋覆花的质量评价提供了依据,同时为其制剂方面的研究提供了借鉴。
       【参考文献】
           [1] 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:227.
       
       [2] 耿红梅,张嫡群,王云志,等.欧亚旋覆花中总黄酮的含量测定[J].中草药,2006,37(3):450.
       
       [3] Shao Y, Bai N, Zhou B. Kaurane glycosides from Inula Britannica[J]. Phytochemistry,1996,42(3): 783.
       
       [4] Park EJ, Kim Y, and Kim J. Acylated flavonol glycosides from the flower of Inula Britannica[J].J Nat Prod,2000,63 (1):34.
       
       [5] 吴一兵,王云志,查建蓬,等.欧亚旋覆花中三萜和甾体化合物的分离和结构鉴定[J].中草药,2006,37(5):666.
       
       [6] 王云志,石晓伟,付 焱,等.1-O-乙酰大花旋覆花内酯对照品的制备及质量研究[J].色谱,2005,23(6):573.
       
       [7] 查建蓬,付 焱,吴一兵,等.欧亚旋覆花挥发油的GC-MS分析[J].中药材,2005,28(6):466.
       
       [8] 付 炎,郭 毅,张嫡群,等.欧亚旋覆花中多糖紫外光谱含量测定方法的研究[J].中草药,2006,37(4):544.
       
       [9] Kim SR, Park MJ. Flavonoids of Inula Britannica protect cultured cortical cells from necrotic cell death induced by glutamate[J].Free Radical Biology & Medicine,2002,32(7):596.
       
       [10] 徐韧柳,李丽华,康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志,2005,12(1):53.

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中药学教材(附图片)

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