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延胡索中紫堇碱标准品的制备及含量测定
作者:白雪, 肖海涛, 杨杰, 朱洁, 郝小燕*    
作者单位:白雪, 肖海涛, 杨杰, 朱洁, 郝小燕*

《时珍国医国药》 2009年 第2期

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       【摘要】 
       目的研究延胡索中紫堇碱标准品的制备及含量测定方法。方法运用半制备高效液相色谱法分离纯化紫堇碱,采用薄层色谱法和高效液相色谱面积归一化法检测纯度,波谱法鉴定其结构,反相高效液相色谱法测定延胡索药材中紫堇碱的含量。结果制备的化合物鉴定为紫堇碱,纯度为99.5%;含量测定在0.131 2 ~1.131 2 μg范围内呈良好线性关系,r = 0.999 997,平均回收率为97.19%,RSD为2.25%(n = 9)。结论该制备方法效率高,所得化合物纯度高,可用于大量制备;含量测定方法准确,简便,可靠,重复性好。
       【关键词】  紫堇碱; 半制备高效液相色谱法; 反相高效液相色谱
       husuo  W. T. Wang
       BAI Xue, XIAO Haitao, YANG Jie, ZHU Jie, HAO Xiaoyan*
       (Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China)
       Abstract:ObjectiveTo study a preparation and determination method of corydaline in Corydalis yanhusuo  W. T. Wang.  MethodsThe corydaline was separated and purified by semi-preparative high performance liquid chromatograph. Its purity was determined by TLC and HPLC analysis and normalization of peak areas. The structure of corydaline was identified by spectrum, and the quantification was determined by RP-HPLC.  ResultsThe compound was identified as corydaline .The purity of the corydalis was 99.5%. There was a good linearity within the range of 0.131 2~1.131 2 μg (r= 0.999 997).The average recovery was 97.19%(RSD=2.25%,n=9) .  ConclusionThis preparation method is quick and convenient for producing the pure compounds from herbs with large capacity. The method is accurate and simple with good reproducibility, and it can control the quality of this herb and preparation effectively.
       Key words:Corydaline;   Semi-preparative high performance liquid chromatograph;  RP-HPLC
       
       延胡索Corydalis yanhusuo  W. T. Wang.为罂粟科植物延胡索的干燥块茎,具有活血化淤、理气止痛的功效,是我国传统常用中药。延胡索中主要含生物碱,其中延胡索乙素和丑素是延胡索镇痛的主要活性成分[1],2005年版《中国药典》及成方制剂中均采用延胡索乙素为对照品进行评价[2~4]。本课题组研究发现,延胡索生物总碱具有较好的抑制乙酰胆碱酯酶的作用,其中紫堇碱是主要活性成分之一,因此,有必要对延胡索中紫堇碱进行定性鉴别和含量测定。但是,目前市场上还没有紫堇碱对照品的销售,并且也未见采用紫堇碱为对照品来评价延胡索质量的报道。本文报道延胡索中紫堇碱对照品的制备方法和含量测定方法。
       1  仪器与材料
       
       X-4型显微熔点仪(国产,温度计未校正);INOVA-400型核磁共振仪 (TMS为内标); KQ-250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);高效薄层层析板(GF254,青岛海洋化工厂生产);甲醇、乙睛为色谱醇,其他化学试剂均为分析醇,水为纯净水。
       
       延胡索药材采自浙江省东阳市,经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang.的干燥块茎。
       2  方法与结果
       2.1  紫堇碱粗提物的制备  延胡索块茎粗粉5 kg,用30倍量的70%乙醇40 ℃超声提取1 h,滤过,滤液减压回收溶剂,得乙醇提取浸膏。乙醇提取浸膏加入1%的盐酸溶液溶解,滤过。滤液用浓氨水调pH 9~10,用乙醚反复萃取,合并萃取液,减压低温回收溶剂,得紫堇碱粗提物。
       2.2  色谱条件
       2.2.1  制备的HPLC色谱条件  XTerra Prep RP-18柱(10 μm ,150 mm × 7.8 mm);柱温为室温;检测波长280 nm;流动相为甲醇-0.03 mol/L的磷酸二氢钠(61∶39);流速3.00 ml/min。
       2.2.2  分析的HPLC色谱条件  DiamonsilTM C18柱 (5 μm, 250 mm× 4.6 mm),柱温30 ℃;检测波长280 nm,流动相为0.10 % 的磷酸(三乙胺调pH = 6.0) -乙睛(48∶52),流速1.00 ml/min。
       2.2.3  紫堇碱对照品的制备纯化  取紫堇碱粗提物1.0 g,用10 ml甲醇超声溶解,过0.45 μm滤膜,备用。吸取1.0 ml样品进半制备型高效液相色谱仪,收集保留时间所在的组分,减压回收溶剂,得紫堇碱粉末。加乙醇适量溶解,重结晶,即得。
       2.3  纯度分析
       2.3.1  薄层色谱分析  薄层板:高效薄层层析板(GF254)。3种展开剂系统:正丁醇-乙酸-水(10∶1∶0.5);醋酸乙酯-氯仿-甲醇-二乙胺(8∶2∶2∶1);乙醚-环己烷-甲醇(5∶3∶0.5)。点样:在同一板上,按20,40,60,80,100 μl不同的浓度点样。展距8 cm,定位后经紫外254 nm、碘蒸气及碘化铋钾溶液显色检视。结果在薄层色谱同一位置处,均为单一斑点,未见杂质斑点,符合化学品要求。
       2.3.2  紫外检测  取紫堇碱对照品乙醇溶液经紫外光谱扫描,结果表明最大吸收波长为280 nm,因此,确定280 nm为测定波长。
       2.3.3  面积归一化法  精密称取紫堇碱对照品,用流动相制成浓度为0.13 mg·ml-1的样品溶液,按照“分析HPLC色谱条件”,进样10 μl,样品显示为单峰,用面积归一化法计算含量为99.5%(保留时间为12.15 min),符合中药化学对照品含量测定用要求。结果见图1。
       2.4   结构鉴定  紫堇碱为无色棱状柱晶(乙醇),熔点135℃。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 0.95 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3), 2.60 (2H, m, 5-H), 3.10 (2H, m, 6-H), 3.22 (1H, m, 13-H), 3.50 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8α), 3.69 (1H, s, 14-H), 3.87 (12H, m, 4-OCH3), 4.20 (1H, d, J = 16.0 Hz, 8-Hβ), 6.61 (1H, s, 4-H), 6.69 (1H, s, 1-H), 6.82 (1H, d, J = 8.4 Hz, 11-H), 6.91 (1H, d, J = 8.4 Hz, 12-H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 18.3 (-CH3), 29.2 (C-5), 38.2 (C-13), 51.3 (C-6), 54.4 (C-8), 55.7 (OCH3), 55.8 (OCH3), 56.0 (OCH3), 60.0 (OCH3), 62.9 (C-14), 108.5 (C-1), 110.8 (C-4), 111.0 (C-4), 124.0 (C-12), 128.5, 128.4, 128.2 (C-4a, -14a, -8a), 134.8 (C-12a), 144.7 (C-10), 147.0 (C-2), 147.5 (C-3), 150.0 (C-9)。以上波谱数据与文献报道[5]的一致,故鉴定为紫堇碱。
       2.5  延胡索中紫堇碱的含量测定
       2.5.1  色谱条件与系统适应性实验  照“分析HPLC色谱条件”,样品的理论塔板数均大于10 000,分离度均大于4.0。结果见图2。
       2.5.2  供试品的制备  取延胡索粗粉约1 g,精密称定,至50 ml具塞三角瓶中,加入70%的乙醇30.00 ml,称重,40 ℃超声提取1 h,取出,补足减失重量,冷却,滤过,取续滤液10.00 ml,回收乙醇,流动相定容至10.00 ml,过0.45 μm滤膜,备用。
       2.5.3  线性范围考察  精密称取紫堇碱对照品0.016 4 g于50 ml容量瓶中,用流动相定容,得对照品储备液。取5.00 ml对照品储备液于25 ml容量瓶中,用流动相定容,得质量浓度为65.6 μg·ml-1的对照品标准溶液。分别精密吸取对照品标准溶液2,4,8,12,16,20 μl注入色谱仪,记录峰面积。以色谱峰面积为纵坐标 (Y),紫堇碱的进样量为横坐标 (X),绘制标准曲线,得回归方程:Y = 942.131 6X + 0.293 7,r=0.999 997,样品在0.131 2~1.131 2 μg范围内线性关系良好。
       2.5.4  精密度实验  精密吸取同一对照品标准溶液8 μl,照前述色谱条件重复进样6次,测得紫堇碱峰面积的RSD为0.25%,表明测定仪器精密度良好。
       2.5.5  稳定性实验  将同一份供试品溶液放置0,2,4,8 h后,照前述色谱条件进样20 μl,测得紫堇碱在8 h内峰面积的RSD为0.21%,表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
       2.5.6  重复性实验  取同一批样品,按“2.5.2”项下方法,平行制备供试品溶液6份,按前述色谱条件进样20 μl,测得延胡索中紫堇碱含量平均值为0.977 8 mg·g-1,RSD为0.41 %,表明测定方法重复性良好。
       2.5.7  回收率实验  取已知含量的样品约0.5 g,共9份,精密称定,分别加入不同量的紫堇碱对照品,按“2.5.2”项下方法制备,按前述色谱条件进样20 μl,测得紫堇碱的平均回收率为97.19%,RSD为2.25%(n = 9),表明测定方法准确可靠。结果见表1。
       表1  回收率实验(略)
       图1对照品的色谱图(略)        
       图2样品的色谱图(略)            
       3  讨论
       
       延胡索生物碱类大部分属于小檗碱或原小檗碱型,它们性质相差较小,极性相近,利用常规的分离方法很难得到高纯度的单体,而高效液相色谱具有柱效高、操作简单、分离出来的化学单体纯度高的特点。我们在利用常规的分离方法制备高纯度的紫堇碱效率较低的情况下,尝试用半制备高效液相来制备紫堇碱单体,结果发现效率高,成本低,适合紫堇碱对照品的大量制备。
       
       延胡索总生物碱在酸水或乙醇中有较好的溶解性能,对于其总生物碱的提取方法,文献报道以回流法为多[6],但此法整个工艺耗时较长,提取率较低。另有文献报道,以氨-乙醚为溶剂,采用超声、冷浸、回流3种方法提取延胡索,结果表明超声提取方法含量高,操作简便。本实验中,紫堇碱的含量测定采用30倍量70%的乙醇40 ℃超声提取1 h,在确定的色谱条件下,分离度已达到要求。而在制备色谱中,采用乙醚进一步萃取纯化,提高了制备效率。
       【参考文献】
           [1] 高学敏. 中药学[M].北京:人民卫生出版社,2000:1061.
       
       [2] 国家药典委员会. 中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005: 94.
       
       [3] 马 红. 扶正益肺巴布膏中延胡索乙素的含量测定[J].中国中药杂志,2007,32 (17):1819.
       
       [4] 龙 进,涂文升. 反相高效液相色谱法测定胃药胶囊中延胡索乙素的含量[J].中国中药杂志,2004,29 (9):914.
       
       [5] 许翔鸿,王峥涛,余国奠,等. 延胡索中生物碱成分的研究[J].中国药科大学学报,2002,33 (6):483.
       
       [6] 邱蓉丽,李 祥,陈建伟,等. 延胡索总碱提取方法研究[J].中医药研究,2000,16(5):50.

经典中医古籍

中药学教材(附图片)

穴位数据库(附图片)