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何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖与凋亡的影响
作者:陈雪 牛嗣云 曲银娥 李亚丽 高福禄    
作者单位:河北医科大学,河北 石家庄 050017; 承德医学院,河北 承德 067000;华北煤炭医学院,河北 唐山 063000;河北省人民医院优生优育优教中心,河北 石家庄 050051;河北师范大学,河北 石家庄 050016

《时珍国医国药》 2009年 第3期

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       【摘要】 
       目的研究中药何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖及凋亡的影响。方法50只SD大鼠随机分为5组:阴性对照组,模型组,何首乌饮高、中、低剂量组,每组10只。D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老大鼠模型。采用SP免疫组化法和原位末端标记法( TUNEL法)分别检测肾脏组织PCNA和凋亡的表达情况。结果①模型组大鼠肾脏PCNA阳性细胞数低于阴性对照组大鼠(P<0.05)。何首乌饮各剂量组PCNA阳性细胞数高于模型组(P<0.05)。②模型组大鼠肾脏TUNEL阳性细胞数高于阴性对照组大鼠(P<0.05)。何首乌饮各剂量组TUNEL阳性细胞数均低于模型组(P<0.05)。结论何首乌饮可明显提高衰老大鼠肾脏的增殖能力并抑制其凋亡,具有一定的延缓衰老作用。
       【关键词】  何首乌饮 衰老 肾脏 增殖细胞核抗原 细胞凋亡
       研究发现在组织器官发育、完善的过程中细胞增殖不但总是与细胞凋亡相伴随[1],而且机体的衰老过程与两者的关系亦密不可分。本实验应用免疫组织化学技术和原位末端标记法( TUNEL)分别检测肾脏PCNA阳性细胞和凋亡细胞在D-半乳糖致亚急性衰老模型大鼠肾脏的表达情况,阐明何首乌饮对衰老肾脏的影响,为研究衰老机制及开发临床抗衰老药物提供理论依据。
       1  材料与方法
       1.1  药品、试剂和实验动物何首乌饮方剂购自承德市肛肠医院;D-半乳糖购于北京化学试剂公司;PCNA购自中杉金桥生物试剂公司;TUNEL试剂盒购自Roche生物试剂公司。清洁级8周龄雄性SD大鼠,体重180~220 g,购自河北医科大学实验动物学部,动物合格证号:605106。
       1.2  何首乌饮药物溶液的制备何首乌饮方剂组成:何首乌(炙)、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓按质量比3∶2∶3∶2∶5∶3比例混合,水浸泡1 h,然后水煎2次,30 min/次,过滤后浓缩至含生药分别为0.75,1.5,3.0 g·ml-1(分别作为低、中、高剂量药液)。4 ℃保存,给药前复温至25~30 ℃。
       1.3  造模及实验分组50只SD大鼠随机分成阴性对照组、模型组、何首乌饮低、中、高剂量组(10,20,40 g·kg-1·d-1),每组10只。阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水,其余4组大鼠腹腔注射D-半乳糖300 mg·kg-1(用生理盐水配制成6%的溶液),连续60 d,制备亚急性衰老大鼠模型[2]。给药组在造模第1日起同时每天一次灌胃何首乌饮,连续60 d;阴性对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水。
       1.4  检测方法
       1.4.1  采用免疫组织化学S-P法按照免疫组化常规步骤操作。石蜡切片的抗原修复采用pH6.0的柠檬酸抗原修复液,加热至沸腾后5 min缓慢冷却;PCNA (抗体稀释比1 ∶200)4℃过夜。以PBS替代一抗作为阴性对照。
       1.4.2  原位末端标记法( TUNEL染色法)将切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上,切片常规脱蜡至水, 各步骤按TUNEL 试剂盒操作,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。以不含末端脱氧核苷酸转移酶的液体代替TUNEL 混合液作阴性对照。
       1.4.3  结果判定 PCNA及TUNEL染色标本细胞胞核染成棕黄色粗颗粒为阳性反应细胞。在显微镜(400×)下,每张切片上随机选取10个视野,计数阳性细胞,每组计数3只动物,每个标本计数3张切片,计算每个视野的平均阳性细胞数。
       1.4.4  数据处理Excel建立数据库,SPSS13.0软件分析,单因素方差分析比较组间差异。
       2  结果
       2.1  免疫组化染色结果各组切片均可见PCNA染色,免疫阳性产物位于细胞核,通常呈棕黄色颗粒状,小部分呈弥散状。免疫阳性细胞主要分布于肾小管,肾小球有少量表达。模型组大鼠肾脏PCNA阳性细胞数低于阴性对照组大鼠,何首乌饮各剂量组PCNA阳性细胞数高于模型组,差异均有统计学意义。见表1。
       2.2  TUNEL染色结果 TUNEL阳性细胞主要表达在肾小管上皮细胞,肾小球仅有少量表达。模型组大鼠中凋亡细胞成簇存在,而在用药组散在分布。模型组大鼠肾脏TUNEL阳性细胞数高于阴性对照组,何首乌饮各剂量组TUNEL阳性细胞数均低于模型组,差异均有统计学意义。见表1。
       表1  各组大鼠肾脏PCNA和TUNEL结果比较(略)
       与阴性对照组比较,▼P<0.05;与模型组比较,▲P<0.05;n=9
       2.3  PCNA和TUNEL的相互关系经相关分析PCNA和TUNEL具有负相关关系(r=-0.912,P=0.000)。
       3  讨论
       
       近年来延缓衰老以及老年病的预防已成为国内外研究的焦点,寻找有效的抗衰老药物是衰老研究中的一个重要方面。由于化学药物的广泛使用及其毒副作用,研究的方向已瞩目于传统中药。何首乌饮由何首乌(炙)、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓组成。何首乌、肉苁蓉、怀牛膝能填精补髓、乌发延年,淫羊藿补肾壮阳以强筋骨,丹参活血化淤以通心脉,茯苓健脾利湿以宁心神。近年研究发现何首乌、淫羊藿、丹参、肉苁蓉等具有改善脂肪代谢、抗衰老等作用[3]。
         
       增殖细胞核抗原( PCNA)是一种只出现在增殖状态细胞核中的蛋白质,其表达合成与细胞增殖周期相关,由G1期开始,于S期达到高峰,至G2期及M期则明显减少[4]。此外它是DNA聚合酶δ的辅因子/辅蛋白,在细胞分裂过程中为DNA合成所必需,协调DNA前导链和后随链的合成[5],因此可以作为一项评估细胞增殖状态的指标[6]。于会民等[7]研究发现生物素通过提高增殖细胞核抗原的转录水平,促进其翻译和合成水平,促进脾脏细胞DNA的合成,从而促进其细胞增殖与分化。陈志宏等[8]研究发现用天年饮灌胃后,睾丸PCNA阳性生精细胞明显增多。本研究显示,PCNA蛋白在何首乌饮各剂量组表达均高于模型组,其中何首乌饮高剂量组的表达最高。提示何首乌饮可以提高细胞PCNA蛋白的表达,促进细胞增殖的作用。
       
       细胞凋亡是细胞受到生理或病理刺激后在基因控制和酶促反应下按一定程序进行的细胞主动死亡过程[9]。可调节多种细胞的数目,在胚胎发育、器官保持自身动态平衡过程中,发挥重要作用。本实验TUNEL法结果显示模型组大鼠中凋亡细胞成簇存在,而在用药组只见散在的凋亡细胞。何首乌饮各剂量组TUNEL阳性细胞数均低于模型组(P<0.05)。庞晓静等[10]报道天年饮灌胃后,垂体前叶凋亡细胞明显减少,阳性细胞总数与模型组、对照组比较均有显著差异(P<0.01),与本实验结果一致。
       
       凋亡与增殖是生物体内重要的生命现象两者之间存在着重要的关联。两者都是一系列基因产物协调表达的结果,其动态平衡对于保持机体的稳定起着重要的作用,其动态失调和机体的衰老过程及疾病的发生都有着密切的关系。何首乌饮一方面可明显提高衰老大鼠肾脏PCNA阳性细胞的表达,起到了促进细胞的增殖的作用另一方面又可以抑制细胞的凋亡,因此何首乌饮可部分保护衰老大鼠的肾脏,具有一定延缓衰老的作用。但是衰老与增殖凋亡的关系极其复杂亦与各种细胞信号传导通路关系密切,其机制有待进一步研究。
       【参考文献】
          [1] Zhang SL, Guo J , MoiniB, et al. Angiotensin II stimulates Pax-2 in rat kidney proximal tubular cells: impact on proliferation and apoptosis [J]. Kidney Int, 2004,66 (6) : 2181 .
       
       [2] 张 丹,张建军.藏药旺拉提取物CE对亚急性衰老小鼠学习记忆以及抗氧化能力的影响[J].中国新药杂志,2005,14(11):1301.
       
       [3] 薛景凤,宋成军,李 健,等. 中药天年饮对衰老大鼠睾丸生精细胞增殖及相关因素的作用[J].时珍国医国药, 2006,17(11): 2161.
       
       [4] Ogata K, Kurki P, Celis JE, et al. Monoclonal antibodies to a nuclear protein ( PCNA / cyclin) associated with DNA replication[J]. Exp Cell Res, 1987, 168 ( 2 ) :475 .
       
       [5] Prelich G, Stillman B. Coordinated leading and lagging strand synthesis during SV40 DNA replication in vitro requires PCNA[J]. Cell , 1988 , 53 (1) :117.
       
       [6] Eldridge S R , Goldsworthy S M. Cell proliferation rates in common cancer target tissues of B6C3F1 mice and F344 rats : effects of age , gender , and choice of marker[J]. Fundam Appl Toxicol , 1996 , 32 (2) :159.
       
       [7] 于会民,蔡辉益,马书宇,等.生物素对肉仔鸡脾脏细胞PCNA 基因的mRNA表达的影响[J]. 畜牧兽医学报,2006 ,37 (11): 1232.
       
       [8] 陈志宏,庞晓静,颜 勇,等.天年饮对亚急性衰老大鼠睾丸组织SOD活性及PCNA表达的影响[J]. 陕西中医,2004,25(6):572.
       
       [9] Meier P,FinchA,Evan G. Apoptosis in development[J].Nature,2000,407:796.
       
       [10] 庞晓静,马建伟,颜 勇,等.亚急性衰老大鼠垂体前叶细胞增殖和凋亡与天年饮的干预效应[J].中国临床康复,2005,9 (27):112.

经典中医古籍

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