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高效液相色谱法测定山香圆中熊果酸含量
作者:朱建华 张志斌 颜日明 曾庆桂 朱 笃    
作者单位:1. 宜春市中医院,江西 宜春 336000; 2. 江西师范大学生命科学学院,江西 南昌 330022

《时珍国医国药》 2009年 第4期

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       【摘要】 
       目的采用高效液相色谱(HPLC)测定山香圆中熊果酸的含量。方法色谱条件:Hypersi ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm;5 μm);流动相为乙腈∶甲醇(体积比为68∶32),检测波长210 nm,流动相流速1.0 ml/min,柱温25℃。结果熊果酸检测的线性范围0.50~10.05 mg (R2=0.998 7) ,平均回收率为99.28%,相对标准偏差(RSD)为1.96%(n=5)。结论 该方法准确、快捷、灵敏、重复性好,可作为山香圆药材及相关制剂质量控制的一个有效方法。
       【关键词】  高效液相色谱 山香圆 熊果酸 含量测定
       山香圆Turpinia arguta Seen为省沽油科属植物,别名千打捶、七寸钉、蛾子药、蛇舌草、白花蛇舌草等,主产于江西、福建、广东、广西等省,性寒味甘苦,具有清热解毒、利尿消肿的功效[1]。山香圆叶中主要有效成分为熊果酸、齐墩果酸、对香豆酸、肉豆蔻酸等[2~5]。熊果酸(ursolic acid, UA)又名乌索酸、乌苏酸,是存在于天然植物中的一种三萜类化合物(图1),相对分子质量为456,具有广泛的生物学效应。体外对G+和G-菌及酵母菌均有抗菌活性;有抗糖尿病、抗溃疡及降低血脂的作用。同时具有抗致癌、抗促癌,诱导F9畸胎癌细胞分化和抗血管生成作用,是一种极佳的灭毒高效新型抗癌药物,另外还具有明显抗氧化功能,并且对中枢神经系统有明显的安定与降温作用,因而被广泛地用作医药和化妆品原料,日益受到重视[6~8]。熊果酸测定方法包括薄层扫描法[9~12]、高效液相色谱法等[13~15]。目前,关于山香圆中熊果酸含量分析方法的报道较少,仅见毛友昌等[11]、魏福有等[12]采用薄层色谱法对山香圆叶和山香圆含片中熊果酸含量进行定量分析。本文建立了山香圆熊果酸含量的高效液相色谱测定法,结果表明此方法操作简便,准确性高,适用于含熊果酸药材及其制剂的质量控制检测。
       1  器材与方法
        1.1  材料与仪器样品:山香圆叶由南昌华依制药有限公司提供;熊果酸对照品:购于中国药品生物制品检定所,批号742.200111;甲醇、乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯;HP1050高效液相色谱仪,配有HP1050色谱工作站、真空脱气机、手动进样器、柱温箱。
        图1  熊果酸的化学结构式
        1.2  对照品储备液的制备称取熊果酸标准样品25.125 mg,置于25 ml容量瓶瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,得含熊果酸1.005 mg/ml的标准溶液。精密移取熊果酸对照品储备液0.5,2,4,8,10 ml,分别置于10 ml容量瓶中。甲醇稀释至刻度,配制成一系列浓度的标准工作液。
        1.3  样品溶液的制备将山香圆样品粉碎,过60目筛,80℃干燥至恒重。精密称取2.0 g,置索氏提取器中,用甲醇适量加热回流提取6 h,提取液用0.45 μm的微孔滤膜过滤,浓缩并定容至25 ml容量瓶中,滤液作为样品溶液。
        1.4  色谱条件Hypersi ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm;5 μm);流动相为乙腈∶甲醇(体积比为68∶32);检测波长210 nm;流动相流速1.0 ml/min;柱温为25℃;进样量为10 ml。
       2  结果
        2.1  色谱条件的选择经紫外光谱扫描,熊果酸的最大吸收波长为210 nm。故本实验采用210 nm作为检测波长。在“1.4”项色谱条件下,熊果酸标准品和样品溶液的保留时间为32 min左右,峰形良好,熊果酸与齐墩果酸分离效果良好(见图2~3)。
        2.2  标准曲线的绘制取按“1.2”项方法制备的储备液进行标准曲线的制备。每个对照品储备液进样10 μl,测定峰面积。以峰面积值(Y)为纵坐标,其对应进样质量浓度(X)为横坐标,进行回归计算,得线性方程为:Y=102.05X-0.796,R2=0.998 7。表明熊果酸的进样量在0.50~10.05 mg范围内线性良好。
        2.3  精密度实验取熊果酸对照品溶液(0.1005 mg/ml)10 ml,重复进样5次,记录峰面积,得其相对标准偏差RSD为1.44%,说明仪器的精密度良好。
        2.4  稳定性实验对同一熊果酸对照品溶液,在0,2,4,6,8,10 h各进样3次,10 ml/次,记录峰面积值,其RSD为0.995%,表明样品溶液在10 h内稳定性良好。
        2.5  重复性实验精密称取2.0 g同一批山香圆样品5份,按“1.3”项所述方法制备样品溶液,同日内测定5次,进样10 ml/次,测得峰面积的日内精密度(以RSD计)为1.89%,表明该方法的重复性良好。
        2.6  加样回收率实验精密称取已知含量的同一批次样品5份,每份样品约2.5 g,置于5个锥形瓶中,精密加入熊果酸对照品溶液1 ml(1.005 mg/ml)。按“1.3”项所述方法制备样品溶液,得到相同浓度溶液5份。按“1.4”项所述色谱条件分析,计算加样回收率,得熊果酸平均回收率为99.28%,RSD=1.96%。结果见表1。表1  熊果酸回收率实验结果
        2.7  样品含量测定取“1.1”项南昌华依制药有限公司提供的山香圆叶,按“1.3”项所述方法制备样品溶液,取同一批号样品溶液3份,在上述色谱条件下直接进样,10 μl/次,每个样品进样3次,取平均值,按回归方程计算得熊果酸的含量为1.025 mg/g。结果见表2。表2  山香圆叶中熊果酸的含量
       3  讨论
        3.1  提取条件的选择根据熊果酸的溶解性能,选择甲醇、无水乙醇、醋酸乙酯、氯仿作为溶剂,对样品进行索氏提取处理,比较了不同提取溶剂对提取效果的影响。结果显示采用甲醇作为溶剂提取率最高,且甲醇提取液色谱图色谱峰分离较好,对熊果酸的测定亦无干扰。因此选用甲醇作为提取溶剂。
        3.2  流动相的选择根据文献报道[14~16],选择甲醇-水(90∶10)、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水(75∶25),甲醇-乙腈-水(64∶20∶16)、甲醇-乙腈(68∶32)等不同流动相进行测定。结果表明甲醇-乙腈(68∶32)作为流动相可得到分散度好的色谱峰,供式品中熊果酸与齐墩果酸的分离度也较高。
        采用高效液相色谱法对熊果酸含量进行分析,对色谱条件进行优化选择,在最佳条件下测定熊果酸标准品,作标准曲线并对提取的熊果酸样品进行了含量测定。分析结果表明,此法简单快速、高效灵敏、重复性好,可用于含熊果酸药材及其制剂的质量控制。
        
       【参考文献】
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