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补阳还五汤对大鼠脊髓损伤后P物质表达的影响
作者:虞琴,陈洪,王敦林    
作者单位:宜春学院,江西 宜春 336000

《时珍国医国药》 2009年 第6期

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       【摘要】 
       目的研究中药补阳还五汤对脊髓损伤后P物质 (SP)表达的影响。方法成年SD大鼠24只,随机分为假手术组、实验组和对照组,每组8只, 实验组和对照组行脊髓右侧半横断损伤后,分别以补阳还五汤和蒸馏水连续灌胃, 用免疫组织化学方法结合图像分析检测脊髓后角内SP的表达变化。结果脊髓后角内SP的阳性神经元数和平均光密度在造模后第32天,实验组和对照组均比假手术组降低,实验组SP的表达明显高于对照组。结论补阳还五汤能使脊髓后角内SP的表达上调,对脊髓半横断损伤后的感觉神经元有保护作用。
       【关键词】  补阳还五汤 脊髓损伤 P物质 脊髓后角
       脊髓是许多神经发挥作用的中介通路。脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)及其继发的病理生理效应可直接导致损伤平面以下的感觉、运动功能丧失及排尿排便功能障碍,因而具有相当高的致残率和死亡率。近年来补阳还五汤(BuyangHuanwu Decoction, BYHWD)在SCI的治疗修复中展示了较好的应用前景,但其作用机制仍不甚明了。本实验拟观察BYHWD对大鼠损伤脊髓P物质表达的影响,旨在为进一步探索中药修复SCI机制的研究提供依据。
       1  材料和方法
       1.1  BYHWD药物的制备
       BYHWD配方具体如下:生黄芪120 g,当归尾8 g,赤芍6 g,地龙5 g,川芎5 g,红花5 g,桃仁5 g。将药物置于砂锅容器中,加入相当于药材体积8倍量的纯净自来水浸泡2 h, 煮沸30 min,过滤药液;再加入5倍量的纯净自来水继续煮沸20 min,过滤,合并两次滤液, 将药液浓缩至含生药浓度2 g/ml,4℃保存备用。
       1.2 动物及分组
       健康成年 SD大鼠24只,体质量200~250 g,雌雄不限。随机分为3组:假手术组、实验组和对照组,每组8只,分笼喂养。
       1.3  大鼠脊髓右侧半横断损伤模型的建立及给药方式健康
        
       SD大鼠腹腔麻醉(3%戊巴比妥钠30 mg/kg)下,固定于自制的木板上,去掉背部手术区附近鼠毛,常规碘伏、酒精消毒,以T10为中心,取背部正中线切口,逐层切开,暴露第10胸椎棘突及椎板,仔细打开椎管,正中线切开硬膜后,用虹膜刀自脊髓后正中沟垂直插入,向右半侧横向切开,再逐层缝合。麻醉清醒后,模鼠均处于右后肢截瘫状态。术后1 h实验组开始按25. 65 g生药/kg剂量灌服BYHWD;对照组不用药物,仅灌服等量的蒸馏水,2次/d,连续32d。假手术组只打开椎板暴露脊髓,不做横切。
       1.4 灌注与取材
       手术32 d后,每组各取8只大鼠麻醉后,经心-升主动脉插管,快速灌注生理盐水100 ml,再以4%多聚甲醛(pH7.4,4℃)灌注固定2 h后,取出损伤区尾侧约4 mm脊髓,假手术组大鼠则灌注后即刻取相应部位的脊髓。进行固定后石蜡包埋、切片(冠状位,片厚25 μm),每5片选3片行免疫组织化学染色。
       1.5 SP免疫组化染色
       切片用兔抗SP 抗体(1∶200,北京博奥森生物技术有限公司) 按常规ABC 法进行免疫组织化学显色,DAB呈色反应棕色,苏木素复染。阴性对照实验, 用PBS 代替第一抗体。
       1.6 染色结果的图像分析及统计学处理
       每只动物随机选取5张脊髓免疫组化显色切片,每张切片随机取5个高倍视野(400×),在普通显微镜下摄片后,用PAS9000病理图像分析软件检测SP免疫阳性神经元数和免疫阳性细胞的平均光密度。实验数据用±s表示,用SPSS13.0 for windows统计学分析软件对免疫组化图像分析结果进行单因素方差分析,以P <0.05为有统计学意义。
       2 结果
       假手术组(见图1a)镜下可见SP阳性物质呈棕黄色颗粒状位于细胞质和突起内,胞核呈蓝色,主要分布于脊髓后角浅层。阴性对照染色未见阳性反应。SP的阳性神经元数和平均光密度值比较,实验组(见图1b)和对照组(见图1c)均比假手术组降低(P <0.05);实验组和对照组比较,实验组SP的表达明显高于对照组(P <0.05)。结果见表1。
       表1  SCI后各组脊髓后角的SP免疫阳性神经元数量和平均光密度值比较(略)
       3 讨论
       P物质(Substance P ,SP)是由11个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢和周围神经系统及组织器官,在外周神经系统中,SP含量比中枢神经系统低。其主要生理功能为感受和防御各种伤害性刺激,维持和修复受损部位的结构和机能[1]。SP是感觉神经的传导物质,其活性的变化反映了脊髓后角的功能状态,也是感觉神经元生长、发育、成熟的标志。
       
       本实验结果显示,术后32 d SP阳性神经元数和阳性细胞的平均光密度实验组和对照组均比假手术组明显减少,从观察结果分析,可能是因为脊髓损伤及继发性损害造成传入神经纤维及轴突破坏,靶源性的神经营养因子来源减少有关。White等[2]应用硅树脂封闭损伤的外周端神经末梢,来阻断外周端靶源性的神经营养因子如NT-3,BDNF等的摄取和运输,结果发现被封闭一侧的脊髓板层出现了SP的缺失。实验组和对照组比较,实验组SP的表达明显高于对照组,表明补阳还五汤能增加脊髓内感觉神经肽SP的表达,对感觉神经元有保护作用。SCI造成的平面以下运动、感觉、反射及括约肌不同程度的功能损伤,古称“体惰”,认为是督脉受损、正气亏虚、脉络瘀阻、筋脉肌肉失养所致。大量研究分析[3],中枢神经系统受损轴突的再生最后以失败告终的原因可能主要在于受损神经元所处的微环境不利于其轴突再生,CNS微环境中缺乏促进轴突再生的神经营养因子,而神经营养因子是再生微环境中的重要因素,在抑制神经元死亡、维持损伤脊髓神经元的存活、促进轴突再生等方面有重要作用。目前,脊髓损伤修复的实验研究主要包括[4]:应用神经营养因子挽救受损的神经元、激发其内源性的轴突再生能力,拮抗再生抑制分子及创造适宜再生的局部微环境的方法等。补阳还五汤为清代医家王清任所创,始载于《医林改错》,该方具有补气活血、通经活络的功效。现代研究表明,补阳还五汤的药理作用极其广泛,具有抗氧化、抗自由基损伤、改善血液流变学、改善微循环和调节免疫等药理作用[5]。SP表达的上调可能是通过改善局部再生微环境,增加神经营养因子的供应,促进了损伤脊髓的轴突再生,通过恢复中枢神经的连续性及神经纤维的轴浆流,使靶细胞产生的神经营养物质得以通过移植物到达其细胞体,以促进神经细胞的代谢和功能恢复。但补阳还五汤修复脊髓损伤的机理还有待于作进一步研究。
       【参考文献】
           [1]罗文君 ,陆婷婷. 神经肽P物质与创伤修复的研究进展[J]. 现代预防医学, 2007, 34(10):1872.
       
       [2]White FA,Kocsis JD. A-fiber sprouting in spinal cord dorsal horn is attenuated by proximal nerve stump encapsulation[J]. Exp Neurol, 2002,177(2):385.
       
       [3]Qin DX, Zou XL, Luo W,et al.Expression of some neurotrophins in the spinal motoneurons after cord hemisection in adult rats[J].Neurosci,2006,410(3),222.
       
       [4]Kwon BK, Borisoff JF, Tetzlaff W. Molecular targets for therapeutic intervention after spinal cord injury[J]. Mol Interv, 2002,2(4):244.
       
       [5]任志宏,韦贵康.中药治疗脊髓损伤的实验研究进展[J].山西中医,2003,19(1): 56.

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