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药用植物泰山四叶参DNA提取方法的研究
作者:史仁玖,王桂龙,宫元伟,郝岗平,王德才    
作者单位:1.泰山医学院,山东 泰安 271000;2.泰山医学院2004级生物技术1班,山东 泰安 271000

《时珍国医国药》 2009年 第6期

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       【摘要】 
       目的探讨不同DNA 提取方法对泰山四叶参DNA 质量的影响。方法对提取的DNA 进行紫外光谱分析、总DNA 电泳及RAPD 分析。结果不同方法提取的DNA 质量及产率存在显著差异。结论结果表明改良CTAB 法和改良SDS 法较好。
       【关键词】  泰山四叶参 基因组DNA DNA 提取方法
       泰山四叶参Codonopsis lanceolata Benth.et Hook.,属桔梗科党参属,泰山四大名药之一,以根为药,具有补血通乳、养阴润肺、益胃生津之功效[1]。本研究旨在利用RAPD 分子标记技术构建不同产地四叶参DNA 指纹图谱,为四叶参真伪鉴定提供分子依据。高质量的基因组DNA 是获取可靠分子标记结果的前提。泰山四叶参多糖、蛋白含量高,不易去除,从而影响DNA 的纯度和浓度。本研究改进了传统的SDS法和CTAB法。采用改良方法所提取的DNA 可作为分子生物学研究的模板,这为RAPD 分子标记和后续的分子生物学研究奠定了重要基础。
       1  器材
       MyCycler梯度PCR 仪(Bio-rad 公司),离心机(Sigma 3K30),DNA 离心真空干燥器(Savan t)。
       
       泰山四叶参叶片采自泰山药用植物园,贮存于-70 ℃冰箱备用。CTAB(上海生物工程技术有限公司) , SDS (上海生物工程技术有限公司),PVP (上海生物工程技术有限公司),β-mercap -toethanol (上海生物工程技术有限公司),Taq 酶(Takara),RAPD Primers(Opron 公司)。
       2 方法与结果
       2.1  DNA 提取方法及检测结果常规SDS 法:参照文献[2]操作;常规CTAB 法:参照文献[3]操作。
       
       改良CTAB 法,参考文献[4]并改进:称取0.2 g 泰山四叶参叶片,液氮研磨成细粉状,加入600 μl核分离液[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 50 mmol/L EDTA (pH 8.0), 700 mmol/L NaCl,2% PVP (W/ V) ,2%β-巯基乙醇(V/V)],迅速研磨成匀浆状,转入1.5 ml 的离心管,4 ℃,5 000 r/min 离心10 min。弃上清,加入600 μl预热的CTAB 核裂解液[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol/L EDTA (pH 8.0),1.4 mol/L NaCl,2%CTAB(W/V),2%PVP(W/V)],65 ℃水浴保温60 min。冷却几分钟后加入600 μl氯仿/异戊醇(V/V为24:1),摇匀室温放置5 min,10 000 r/min 离心10 min,重复抽提1次。取上清,加入1/5体积的5 mol/L 的NaCl,加入2/3 体积的预冷异丙醇摇匀,室温放置15 min 后可见白色丝状DNA 沉淀析出。室温离心去上清后加入70% 的乙醇清洗2 次,真空干燥后加入200 μl TE 溶解沉淀,加入RNase A 至终浓度为10 μg/ml,37 ℃水浴保温30 min。加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10 000 r/min,室温离心10 min,取上清加入1/10 体积的3 mol/L NaAc(pH 5.2),混匀后再加入2 倍体积的无水乙醇,-20 ℃ 放置30 min。离心,弃上清,70%的乙醇清洗2次,室温风干后溶于50 μl的TE 中,-20 ℃ 贮存备用。
         
       改良SDS 法,参考文献[5]并改进:称取0.2 g四叶参幼叶于预冷研钵中,液氮研磨成细粉状后立即加入600 μl核分离液,迅速研磨成匀浆状,小心转入1.5 ml的离心管。4 ℃,5 000 r/min离心10 min;弃上清,加入600 μl预热的SDS 核裂解液,同时洗净管盖及管壁上残留的植物组织,用灭菌牙签轻轻混匀,65 ℃水浴保温60 min,期间不时轻轻摇动离心管几次;冷却几分钟后加入600μl氯仿/异戊醇(V/V为24:1)摇匀室温放置5 min,10 000 r/min,离心10 min。转移上清,重复抽提1次;取上清,加入1/5 体积的5 mol/L 的NaCl,混匀,加入2/3 体积的预冷异丙醇摇匀。4 ℃放置30 min,此时可见白色絮状DNA 沉淀析出于离心管液相中上部,而细胞碎片及其它杂质沉淀于离心管底部;用灭菌牙签将DNA 沉淀挑出,用70% 的乙醇漂洗2次,真空干燥后加入200 μl TE溶解沉淀,加入RNase A 至终浓度为10 μg/ml,37 ℃水浴保温30 min;加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10 000 r/min,室温离心10 min,取上清加入1/10 体积的3 mol/L NaAc(pH5.2),混匀后再加入2倍体积的无水乙醇,-20 ℃ 放置30 min;离心,弃上清,沉淀用再70%的冷乙醇清洗2次,真空干燥后溶于50 μl的TE中,-20 ℃ 贮存备用。
       
       用0.8% 琼脂糖电泳和紫外分光光度计测定A260/A280的方法判定DNA 的质量。
       
       4 种方法提取泰山四叶参叶片DNA,结果表明常规SDS法和常规CTAB 法提取的基因组DNA  样品中蛋白质含量较高,A260 /A280 比值均小于1.75,样品的浓度较高;改良SDS 法和改良CTAB  法提取的基因组DNA 样品浓度较低,分离的基因组DNA 样品中蛋白质含量较低,A260 /A280 比值均接近1.80,从纯度的角度可以看出,这是两种较好的提取方法(表1)。表1  4种方法提取泰山四叶参叶片基因组DNA 产率(略)
       从电泳结果(见图1)可看出,4 种方法提取的DNA均能用电泳检出并且可以看出,用SDS 法提取到DNA 的完整性不好,在加样孔有大量未电泳物质,可能是多糖或者蛋白质;条带不整齐,表明粘度较大;电泳带型很弱, 可见样品中DNA 含量较少;电泳有拖带现象出现,显示有部分DNA 发生降解。而CTAB 法提取到的DNA ,加样孔有未电泳物质,可能有蛋白质存在,DNA 条带较整齐。改良CTAB 法和改良SDS 法提取的DNA 电泳在加样孔无剩余物,所提取DNA 完整性好,电泳带型清晰、完整、均匀一致, 改良CTAB 法提取的DNA 含量比改良SDS法高。
       2.2 RAPD 实验分析
       DNA 质量选择4条不同的随机引物做RAPD 试验。随机引物选用美国Opron 公司的OpA 218 ( 5′AGGTGACCGT 3′) 、OpC201 ( 5′TTCGAGCCAG 3′)、OpA 167 ( 5′CGGAGTCGAT3′) 和OpC236 ( 5′CCGGTCGCTC 3′)用于扩增。RAPD的反应体系为:Taq 酶0.04 U/μl、dNTP 0.30 mmol/L、Primer 1.0 μmol/L、Mg2+ 1.5 mmol/L、模板1.0 mg/L,10×PCR缓冲液2.5 μl,ddH2O 补足25 μl。反应程序为94 ℃预变性4 min,94 ℃变性1 min,38 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min, 40 个循环,最后延伸1.5 min。1.5% 琼脂糖凝胶电泳观察、记录。
       
       RAPD 分析表明,4条引物在均可扩增出清晰的条带,有很好的多态性。两种来源DNA扩增条带清楚、结果相似,重复性较好,说明用改良CTAB 法和改良SDS 法所提取的DNA 满足RAPD 分析的需要。总体上,CTAB 改良法获得的基因组DNA 的扩增谱带更清晰,所获得的谱带更丰富,说明此种情况下所获得的基因组DNA 的质量最高(见图2)。
       3 讨论
       
   
       高质量的基因组总DNA 是进行各项分子生物学实验操作的基础。泰山四叶参叶片中含有大量的多糖、蛋白质、多酚和色素类等次生代谢物质,这给DNA 的提取带来一定难度。在研究中用常规CTAB 和SDS 方法提取的总DNA色黄黏稠,含有大量多糖等杂质,常规SDS 法提取四叶参基因组DNA的效果最差,A260/A280的比值为1.64;电泳图上有拖尾现象,说明DNA 有一定程度的降解;点样孔处最亮,表明该方法去除多糖和蛋白质的效果不好。CTAB 是一种阳离子去污剂,能裂解细胞、破坏细胞膜系统、使蛋白质变性,传统CTAB 法提取得到的DNA沉淀粘滞性很高,推测是多糖或蛋白质,因为在0.8% 的琼脂糖凝胶电泳图上可以看到该方法相对应的点样孔处较亮,但相对传统SDS 法,该方法去多糖的效果要好一些。改良SDS 法和改良CTAB 法要明显优于前两种方法,因为结合四叶参的自身性质,采用核分离液在核裂解之前将存在于细胞质中的次生物质先除去,这样就去除了大部分的次生物质。
       
       改良CTAB 法根据细胞区室化原理,即多糖和多酚类物质及其他杂质与DNA 相互隔离的特性,在加CTAB 裂解液之前,先用一种能维持细胞核内外渗透平衡的提取缓冲液进行抽提,这样可在细胞核裂解前将细胞间和细胞质中的多糖及酚类杂质去除,避免DNA 受大量杂质的污染[6]。为了有效地去除多糖和多酚类等物质的干扰,提取缓冲液中除含有维持渗透平衡的葡萄糖外,还加入了2% 的可溶性PVP、2% 的β-巯基乙醇和1.4 mol/L 的NaC1。PVP 可与酚类物质结合形成水不溶性的复合物[7],β-巯基乙醇可以抑制酚类物质氧化的作用,有效地防止了提取过程中组织褐化现象的产生[8];1.4 mol/L 的NaC1 高盐溶液增加了淀粉在乙醇中的溶解度,从而使DNA 优先沉淀,有效去除了淀粉和其他多糖,降低了多糖类物质对DNA提取的影响[9]。同时改良CTAB法通过提高裂解液中CTAB 的含量,使之尽可能破碎细胞核,充分结合DNA,让DNA 完全与蛋白质解离,RAPD 分析表明,改良CTAB 法是最适于四叶参基因组DNA 提取的方法,能够得到产量、纯度、大小都符合要求的DNA,且方法相对简便。
       【参考文献】
           [1]邓立东,蒋学华,徐勤,等.四叶参的研究进展[J].中国药房,2006,17(23):1824.
       
       [2]萨姆布鲁克 J,拉塞尔 D W.分子克隆实验指南,第3版[M].北京:科学出版杜,2002.
       
       [3]D. Puchooa. A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from lychee (Litchi chinensis Sonn.) [J]. African Journal of Biotechnology , 2004,3 (4), 253.
       
       [4]陈昆松,李方,徐昌杰,等.改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取[J].遗传,2004,26(4):529.
       
       [5]丁晓东,吕柳新.从顽拗植物荔枝中提取基因组DNA技术的研究[J].应用与环境生物学报,2000, 6(2):142.
       
       [6]马辉,张智俊,罗淑萍,等.药用植物白术DNA提取方法的研究[J].新疆农业大学学报,2007,30(2):13.
       
       [7]Li JT, Yang J, Chen DC,et al. An optimized mini-preparation method to obtain high-quality genomic DNA from mature leaves of sunflower[J]. Genet Mol Res, 2007, 6(4):1064.
       
       [8]包英华,白音.美花椒石斛基因组DNA提取方法研究[J].热带亚热带植物学报,2007,26(3):147.
       
       [9]E.G. Wulff, S. Torres, E. Gonzales Vigil. Protocol for DNA extraction from potato tubers[J]. Plant Mol. Biol. Rep. 2002, 20(6):187a.

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