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复方丹参注射液抗睾丸缺血再灌注损伤的实验研究
作者:蒋红梅,逯惠敏,刘莲    
作者单位:贵阳医学院,贵州 贵阳 550004

《时珍国医国药》 2010年 第1期

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       【摘要】 
       目的探讨复方丹参注射液抗缺血再灌注损伤作用。方法建立人尸睾丸离体缺血再灌注损伤模型,用复方丹参注射液干预后,观察睾丸形态结构,并以TUNEL技术显示生精细胞凋亡,NADPHd法显示一氧化氮合酶(NOS)活性,硝酸盐还原酶法测定组织匀浆NO含量。结果缺血再灌注使睾丸组织结构破坏,生精细胞凋亡指数增高,NOS活性增强,NO合成增多;复方丹参注射液干预明显改善了睾丸组织形态,并使细胞凋亡指数和NO生成量显著下降,NOS活性降至正常水平。结论活血化淤中药复方丹参注射液具有显著的改善缺血再灌注损伤作用,调节NOS活性,降低损伤组织中NO水平可能是其作用机制之一。
       【关键词】  缺血再灌注损伤; 睾丸; 丹参; 细胞凋亡; 一氧化氮
        An Experimental Study on the Protective Mechanism of Compound Salvia Miltiorrhiza Injection against Testes Ischemia-Reperfusion InjuryJIANG Hong-mei,LU Hui-min,LIU Lian Department of Clinical Laboratory Science, Guiyang Medical College, Guiyang 550004,ChinaAbstract:ObjectiveTo explore the protective mechanism and effect of compound salvia miltiorrhiza injection against ischemia-reperfusion injury (IRI). MethodsThe isolated human testes IRI model was set up, and compound salvia miltiorrhiza injection was used in the experimental group. Histological changes were observed, cell apoptosis was detected by TUNEL technology, activity of nitric oxide synthetase (NOS) was detected by NADPHd method, and concentration of nitrous oxide (NO)was detected by nitrate reductase method.ResultsIschemia-reperfusion could destroy histological structure of testes; the apoptotic index, the NOS activity and the NO concentration were increased. Compound salvia miltiorrhiza injection could down-regulate all indexes. ConclusionCompound salvia miltiorrhiza injection can prevent the tissue from IRI by regalating the No level.
       Key words: Ischemia-reperfusion injury;   Testes;Salvia Miltiorrhiza;Apoptosis;Nitrous oxide
        缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的机制和防治研究对休克治疗、动脉搭桥、溶栓疗法、心脏外科体外循环、断肢再植和器官移植等临床技术的发展具有重要意义。一氧化氮(nitrous oxide,NO )可能在缺血再灌注所致组织器官结构和功能损伤的过程中起了重要作用[1]。我们建立人尸睾丸离体缺血再灌注损伤模型,用活血化淤中药复方丹参注射液进行干预后,观察睾丸的组织形态、生精细胞凋亡指数、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase,NOS)活性及NO含量的影响,了解该药抗缺血再灌注损伤的作用及机制。
       1  材料与仪器
        26人捐赠尸睾。复方丹参注射液[20 g·(10ml)-1,每毫升含相当于原生药丹参Salvia miltorrhiza Bge,降香Dalberga odorifere T. chen各1g,批号001208,华西医科大学制药厂提供];高渗枸橼酸盐嘌呤液(规格为每袋500 ml,上海市血液中心)。SDJS-2型精密输液器即蠕动泵(浙江新昌国康仪器厂),小型三用水浴箱(温度范围37~100℃,温波1℃,北京市医疗设备厂)。
       2  方法
       2.1  睾丸离体缺血再灌注损伤模型建立
       26对睾丸离体后立即置于4℃高渗枸橼酸盐嘌呤液中,剔除鞘膜及多余结缔组织,精索动脉插管固定,4℃高渗枸橼酸盐嘌呤液灌洗至精索内静脉流出液清亮后,备用。其中6对睾丸立即取材作正常对照(12只)。其余20对睾丸中,每两只分别分配到缺血再灌注组(20只)和复方丹参组(20只)。缺血再灌注组用4℃高渗枸橼酸盐嘌呤液低温灌洗至精索内静脉流出液清亮后置于250 ml该保存液中4℃冷存12 h,再以500 ml保存液复温至37℃行循环灌注6 h;复方丹参组用含1.5 mg·ml-1 复方丹参注射液的高渗枸橼酸盐嘌呤液同样操作。
       2.2  组织学及酶组织化学
       染色常规石蜡切片HE染色,观察睾丸组织学结构。新鲜冰冻切片按NADPHd组织化学法[2]显示一氧化氮合酶(NOS),阳性反应为蓝色沉淀。用Nikon Eclipse E600光学显微镜观察,并用Spot Advanced 3.0.4.软件采集图象,Image-Pro Plus 4.1.0.9软件计算灰度值(Integrated optical density,IOD,= Area×Average Density)。
       2.3  睾丸组织细胞凋亡检测
       睾丸组织石蜡切片采用DNA原位缺口末端标记(TUNEL)技术染色[3](试剂盒购自青岛海泰生物技术有限公司)显示凋亡细胞。阳性细胞的细胞核被染成棕黄色。计数睾丸生精细胞凋亡指数(即每500个细胞核中的阳性细胞核的数目)。
       2.4  睾丸组织匀浆NO含量测定
       每克睾丸组织加5 ml生理盐水,制备20%睾丸组织匀浆,离心取上清,硝酸盐还原酶法[4]测定NO含量。检测试剂盒购自南京建成生物工程公司。
       2.5  统计学处理
       数据以±s表示,SPSS统计软件包进行t检验。
       3  结果
       3.1  睾丸组织形态观察
       3.1.1  正常对照组曲细精管圆形或椭圆形,各期生精细胞分布正常,间质中血管完整,内皮细胞层呈扁平梭状。
       3.1.2  缺血再灌注组血管内皮细胞肿胀脱落,曲细精管萎缩,基膜与生精上皮明显分离,生精细胞排列紊乱,数量明显减少,间质水肿。
       3.1.3  复方丹参组形态结构基本正常,仅见少数血管内皮细胞肿胀。
       3.2  各组睾丸组织细胞凋亡指数、NOS活性和组织匀浆NO含量比较 缺血再灌注组睾丸组织细胞凋亡指数、NOS活性和组织匀浆NO含量均显著高于正常对照(P<0.05,0.05,P<0.001);复方丹参组各项指标均显著低于缺血再灌注组(P<0.01,0.01,P<0.001),与正常对照组相比,细胞凋亡指数和组织匀浆NO含量仍较高(P<0.01),NOS活性无显著差异。结果见表1。表1  各组睾丸组织细胞凋亡指数、NOS活性
       和匀浆NO的含量(略)
       4 讨论
        结合中医学理论和现代医学知识,笔者认为缺血再灌注损伤具有血瘀证的基本病理改变,如血液粘度增高、高凝状态,血栓形成,毛细血管嵌顿、阻塞等。且有研究证明活血化瘀中药丹参可通过抗氧化、扩张周围血管、降低血液粘度等机制保护低温保存器官[5]。本研究建立人尸睾丸离体缺血再灌注损伤模型,用复方丹参注射液进行干预,探讨该药抗缺血再灌注损伤的作用效果及机制。结果发现,缺血再灌注使睾丸形态结构明显破坏,生精细胞凋亡指数,组织NOS活性和NO含量显著增高;而复方丹参注射液干预可明显减轻组织结构的损伤,使凋亡指数、NOS活性及NO生成量显著下调。
       
       有研究者曾建立离体大鼠心肌缺血再灌注Langendorff模型于体外研究缺血再灌注[6]。我们用捐赠人尸睾丸建模,所得结果对研究人类实质器官缺血再灌注损伤更具指导意义。已有研究报道,缺血再灌注可引起细胞内Ca2+堆积,上调NOS活性,从而持续生成过量NO[7]。而高浓度NO可能通过多种途径诱导细胞凋亡。大量NO与相互作用生成细胞毒性物质ONOO-和OH-,损伤DNA;过量NO与FeS复合物结合,抑制许多FeS酶的正常功能,导致线粒体功能损伤和细胞DNA合成障碍;NO能刺激TNF相关的凋亡诱导配体表达,将死亡信号传递到胞内,激活半胱天冬蛋白酶系统,上调p53,抑制NFκB活化促进细胞凋亡[7]。本研究也进一步证实,NO是缺血再灌注导致组织损伤的一条重要途径,并发现活血化淤中药丹参注射液可抑制组织NOS活性,保持组织中NO的正常水平,抑制细胞凋亡,从而发挥良好的抗缺血再灌注损伤作用。
       【参考文献】
         1]李胜富,蒋红梅,李幼平,等. 人内皮细胞缺氧再给氧损伤及益生注射液对其拮抗机理研究[J]. 华西医科大学学报,2002,33(2):215.
       
       [2]杨静,刘志华,程绪杰,等. 辛伐他汀对内皮细胞分泌NO、NOS的影响[J]. 苏州大学学报(医学版), 2006, 26(6): 983.
       
       [3]高翠莲,陈玉川,肖俊辉,等. TUNEL法检测大鼠死后心肌细胞核DNA断裂与死亡时间关系研究[J]. 中国法医学杂志, 2007, 22(5):299.
       
       [4]王松,段春燕,王 清.1,25-二羟维生素D3对脊柱结核患者外周血单个核细胞的NO及iNOS的影响研究[J]. 中国药房, 2008,19(19): 1474.
       
       [5]杨文锋,王善政,陈景寒,等. 丹参在家绵羊主动脉组织低温活性保存中的作用研究[J]. 上海中医药杂志,2003,37(1):54.
       
       [6]王海英,喻田,刘兴奎,等. 吡咯二硫氨基甲酸酯联合超极化停搏液对兔离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中华麻醉学杂志,2005,25(5):351.
       
       [7]武宏敏,张建新.一氧化氮与心肌缺血再灌注损伤[J]. 河北医药,2008,30(6):836.

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