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清热祛湿法对实验性溃疡性结肠炎大鼠黏膜损伤的影响
作者:张海燕,黄穗平,黄绍刚,张向飞,王静    
作者单位:1.广东省中医医院,广东 广州 510120; 2.广州中医药大学2007级硕士,广东 广州 510405

《时珍国医国药》 2010年 第2期

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       【摘要】 
       目的探讨清热祛湿法(肠涤清灌肠液灌肠+肠炎清1号灌胃)对实验性溃疡性结肠炎(UC)大鼠黏膜损伤、血清和结肠组织中SOD活力及MDA含量的影响。方法成年雌性SD大鼠51只,先随机抽取8只大鼠作为正常组,不予造模;剩余的43只大鼠予造模后,第3天随机抽取2只解剖,观察造模是否成功;剩余的41只大鼠随机分为模型组11只,肠涤清组、肠涤清+肠炎清组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组各10只。造模后第4天开始,正常组和模型组给予生理盐水灌肠、其余三组分别给予肠涤清灌肠、肠涤清灌肠+肠炎清灌胃、SASP灌肠+灌胃,疗程2周。分别从大鼠的一般状况、结肠黏膜损伤指数及病理形态变化、血清和结肠组织中SOD活力及MDA含量的变化来观察清热祛湿法对2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的实验性UC大鼠的作用机制。结果与模型组和其他两个治疗组比较,肠涤清+肠炎清可以显著改善UC大鼠的腹泻和便血情况,减轻结肠黏膜损伤指数,改善结肠黏膜的病理形态学情况,提高血清和结肠组织中SOD活力,降低血清和结肠组织中MDA含量。结论肠涤清和肠炎清可能通过提高血清和结肠组织中SOD活力及降低MDA含量来达到对实验性UC大鼠的治疗作用。
       【关键词】  清热祛湿法 溃疡性结肠炎  肠炎清1号 肠涤清灌肠液
       Effect of the Method of Removing Heat and Dispersing Dampness on Experimental Ulcerative Colitis in Rats
       ZHANG Haiyan, HUANAG Suiping,HUANG Shaogang,ZHANG Xiangfei,WANG Jing
       1.Dept. of Internal Medicine,Guangdong Hospital of TCM,Guangzhou 510120,China;2.Master. 2007,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China
       Abstract:ObjectiveTo study the effect of the method of removing heat and dispersing dampness experimental ulcerative colitis (UC) in rats.Methods8 rats were randomly selected as the normal group from 51 healthy female Sprague-Dawley (SD) rats.Active UC was induced by trinitro-benzene-sulfonic acid(TNBS) and ethanol solution in 43 rats.Three days after establishing the model of UC,the rats were randomly divided into four  groups:11 in model group,10 in Changdiqing group,10 in Changdiqing + Changyanqing group and 10 in salicylazosulfapyridine (SASP) group.Four days after establishing the model of UC,the rats in both normal and model groups were treated with normal Saline enema (NSE).  Rats in the other 3 groups were treated with Changdiqing enema,Changdiqing enema plus Changyanqing gavage,and SASP by gavage and enema,respectively.The course of treatment was 2 weeks and general condition, CMDI,dynamic changes of SOD activity and MDA level in serum and tissues of colon were observed.ResultsThe combination of Changdiqing and Changyanqing could significantly improve the symptoms of diarrhea and hematochezia, decrease the ulcer index of colonic mucosa,aleviate the pathological changes, increase SOD activity in serum and tissues of colon, and decrease the level of MDA in UC model rats compared with normal saline enema and the other two treatment groups.ConclusionThe therapeutic effect of the combination of Changyanqing and Changdiqing in experimental UC rats might result from the increase of  SOD activity and decrease of  MDA level in serum and tissues of colon.
       Key words: The method of removing heat and dispersing dampness;  Ulcerative colitis (UC);  Changyanqing 1;  Changdiqing fluid
        近年来溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)在我国的发病率呈逐渐升高趋势,且被认为是结肠癌的癌前病变,已被世界卫生组织列为现代难治病之一。在临床实践过程中,我们发现活动期UC的病机特点以大肠湿热为主,治疗当以清热祛湿为法。中医药治疗本病具有独特优势,肠涤清灌肠液和肠炎清1号方已在广东省中医院使用近十年,治疗活动期大肠湿热型UC疗效显著。为探讨清热祛湿法(肠涤清灌肠液灌肠加肠炎清1号方灌胃)对UC的作用机理,本实验观察了该方法对实验性UC大鼠黏膜损伤、血清和结肠组织中SOD活力及MDA含量的影响。现报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1  动物SPF级健康成年雌性SD大鼠51只,体质量为200~230 g。由广东省医学实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(粤)2003-0002,粤监证字2007A003。
       1.2  药物肠涤清灌肠液:由黄柏30 g,败酱草20 g,大黄20 g,地榆30 g,白及15 g等药物组成。购于广东省中医院,由广东省中医院制剂部煎制,每剂煎150 ml备用,密封保存,温热后灌肠。
       
       肠炎清1号方:由黄芩10 g,黄连10 g,白头翁15 g,秦皮10g,木香5 g,芍药15 g,蛇舌草20 g,炒当归5 g,元胡15 g,甘草5g等药物组成。购于广东省中医院,由江阴天江药业有限公司制成中药配方颗粒,加开水溶解后配制为含生药1 g/ml溶液,置4℃的冰箱保存备用,温热后灌胃。
        柳氮磺吡啶肠溶片(SASP):上海三维制药有限公司生产(批文号:国药准字H31020450),规格:每片0.25 g。用刀片轻轻刮去外层包衣后研为细粉,用蒸馏水配成30 mg/ml的混悬液,置4℃的冰箱保存备用,温热后灌胃及灌肠。
       1.3  试剂2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS):由美国sigma公司生产,批号为[107K5008],分子量为:293.2,浓度为5%,购于上海Sigma-Aldrich生物技术有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)测试盒:购于南京建成生物工程研究所,批号:20080412;丙二醛(MDA)测试盒:购于南京建成生物工程研究所,批号:20080524。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒:购于南京建成生物工程研究所,批号:20080530。
       1.4 仪器高速离心机:德国sigma公司生产的LD4-2A离心机;组织匀浆机;宁波生物科技有限公司生产的电动玻璃匀浆机;光学显微镜:Motic公司BA200型。分光光度计:UV-7504紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)。
       2  方法
       2.1  大鼠分组SPF级健康成年雌性SD大鼠51只,采用架式笼养喂养。先随机抽取8只大鼠作为正常组,不予造模。剩余的43只大鼠予造模后,第3天随机抽取2只解剖,观察造模是否成功;剩余的41只大鼠随机分为4组:模型组(空白组)11只;肠涤清灌肠液灌肠组(简称肠涤清组)、肠涤清灌肠液灌肠+肠炎清1号灌胃组(简称肠涤清+肠炎清组)、SASP灌肠+灌胃组(简称SASP组),每组10只。
       2.2  造模方法参照参考文献[1]:将大鼠禁食不禁水24 h后,腹腔注射10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g),固定于鼠解剖台上,将一直径2.0 mm长约11 cm的橡胶输液管,由肛门轻缓插入深约8 cm,给予2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇溶液0.25 ml)缓缓注入到大鼠肠腔内,再注入少许空气,提起大鼠尾部,倒置30 s,使造模剂充分渗入大鼠肠腔。让动物保持平躺自然苏醒,各组大鼠苏醒后正常饲养。观察大鼠体重、进食量、饮水量、毛发光泽度、大便性状以及活动情况。
       2.3 给药方法按照公式:大鼠用药剂量(mg/kg)=5倍成人用药量(mg/kg),各组动物在正常饲养的基础上,从造模后第4天开始用药。第1组为正常组:每天定时用生理盐水灌肠,2 ml/200g。第2组为模型组:每天定时用生理盐水灌肠,2 ml/200g。第3组为肠涤清组:每天定时用肠涤清灌肠,2 ml/200 g。第4组为肠涤清+肠炎清组:每天定时用肠涤清灌肠,2 ml/200 g;肠炎清1号灌胃,2 ml/200 g。第5组为SASP组:每天定时用SASP灌肠,2 ml/200 g;同时配合灌胃,2 ml/200 g。上述用药皆1次/d,治疗均为2周。
       2.4  取材大鼠禁食不禁水24 h后,用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g),迅速剖腹,腹主动脉取血2 ml,离心后置-80℃冰箱保存备用。将距肛门12 cm长的末端结肠取出,沿肠系膜缘剪开肠腔,用冷生理盐水冲洗肠内容物,将黏膜向上展开,肉眼观察黏膜损伤并进行评分,结肠黏膜损伤指数(CMDI)的半定量标准参照 Vilaseca[2]等制定的评分标准(见表1)。再取病变最明显处2 cm左右,放至-20℃冰箱速冻,然后移至-80℃冰箱冷冻保存。最后再留取各组大鼠结肠病变最明显处组织若干,10%福尔马林溶液浸泡固定,以备制作病理切片。表1  结肠黏膜损伤评分标准(略)
       2.5  检测方法SOD、MDA检测方法严格按照试剂盒说明操作,由广州威佳科技有限公司检测。病理切片由广州中医药大学病理教研室制作。
       2.6  统计方法统计学处理采用SPSS13.0软件进行分析。数据的一般性分析及统计推断:采用双侧检验,检验水平α=0.05。所有计量资料均用 ±s表示。若数据符合方差齐性,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验;若数据方差不齐,则采用非参数检验方法。两个变量的相关性分析采用非参数Spearman秩相关检验方法。
       3  结果
       3.1  一般情况正常组:大鼠活动正常,反应灵活,毛色光润,饮食正常,大便呈颗粒状,无稀便及脓血便。模型组:在造模后的第2天即出现稀烂便,随后相继出现黏液便、脓血便,伴有反应迟钝,不喜活动,倦怠懒动、毛发凌乱、拱背、饮食饮水减少、体质量减轻,甚至死亡现象。到实验结束时,仍排稀烂便。3个用药组:在用药1周后大鼠黏液血便逐渐减少,活动逐渐增多,饮食饮水量逐渐增加,其中以肠涤清+肠炎清组大鼠症状改善最为显著,实验结束时,部分大鼠已排颗粒状大便。
       
       实验结束时,模型组有5只大鼠死亡,肠涤清组有1只死亡,肠涤清+肠炎清组有3只死亡,SASP组有2只死亡。其中肠涤清+肠炎清组有2只大鼠是在灌胃过程中窒息而死,立即打开腹腔观察,发现肠外壁与周围组织无明显黏连,纵行剪开肠管,局部肠壁略厚,可见散在糜烂、浅溃疡,周围黏膜略充血、水肿,已无较大较深溃疡;由于所配制的肠炎清1号药液较黏稠,在灌胃过程中误入气管,引起窒息而死亡,考虑死亡原因与UC本身无关。其余大鼠均死于“巨结肠”或腹泻导致的严重营养不良。
        造模后第3天从43只大鼠中随机抽取2只解剖,肉眼观察到结肠黏膜表面充血水肿、糜烂、点状或片状出血、溃疡形成。光镜下可见大量急性炎症细胞浸润,溃疡达黏膜肌层,证明大鼠UC模型造模成功,可以进行本实验研究。
       3.2  结肠黏膜损伤及病理形态学的变化
       3.2.1  肉眼观察结肠黏膜损伤情况肉眼观察结肠黏膜损伤大体情况:正常组大鼠结肠黏膜皱襞纹理清晰,未见炎症、糜烂及溃疡;模型组大鼠病变结肠外壁与周围组织黏连,肠壁明显增厚,黏膜明显充血水肿,可见糜烂及溃疡;其他3组大鼠肠壁黏连情况减轻,肠壁增厚较轻,黏膜轻度充血水肿,糜烂、溃疡减轻,肠涤清+肠炎清组充血水肿最轻,已无溃疡,具体各组大鼠CMDI比较详见表2。
       3.2.2  光学显微镜观察结肠黏膜病理形态正常组:大鼠结肠四层结构清晰,黏膜上皮完整、连续,腺体排列规则、分泌功能活跃,未见炎细胞浸润及血管反应。见图1。
        模型对照组:结肠黏膜可见不同程度的灶性糜烂及溃疡,有的溃疡深达肌层甚至穿孔(可见溃疡底部有渗出物、大量坏死组织、肉芽组织及少量瘢痕组织)。黏膜层变薄,黏膜腺体有不同程度破坏,黏膜及黏膜下见大量炎性细胞(淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞) 浸润,黏膜下层局部充血、水肿。见图1。
       
       3个用药组:溃疡较浅表或无溃疡,溃疡旁上皮修复明显,腺体增生活跃,隐窝、肠腺及间质可见较多淋巴细胞为主的慢性炎性细胞浸润。见图1。表2  各组大鼠CMDI比较(略)
       3.3  血清和结肠组织中SOD活力结果各组大鼠血清和结肠组织中SOD活力检测结果见表3。表3  各组大鼠血清和结肠组织中SOD活力检测结果比较(略)
       采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验。与正常组比较,①P<0.01;与模型组比较,②P<0.01,③P<0.05,④P>0.05;与肠涤清组比较,⑤P<0.01,⑥P<0.05,⑦P>0.05;与SASP组比较,⑧P<0.01
       3.4  血清和结肠组织中MDA含量结果各组大鼠血清和结肠组织中MDA含量检测结果,见表4。表4  各组大鼠血清和结肠组织中MDA含量检测结果比较(略)
        采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验。与正常组比较,①P<0.01;与模型组比较,②P<0.01,③P<0.05、④P>0.05;与肠涤清组比较,⑤P<0.05,⑥P>0.05;与SASP组比较,⑦P<0.05
       3.5  CMDI与SOD、MDA的相关性分析CMDI与SOD、MDA的相关性经Spearman秩相关检验,发现CMDI与血清和结肠组织匀浆SOD活力呈负相关(P<0.01),SOD活力越高,黏膜损伤越轻;CMDI与血清和结肠组织匀浆MDA含量呈正相关(P<0.01),MDA含量越高,黏膜损伤越严重。见表5。表5  CMDI与SOD、MDA的相关性分析(略)
       4  讨论
        TNBS和乙醇联合造模时,在乙醇灼伤结肠黏膜后,TNBS与组织蛋白的赖氨酸ε-氨基团结合,成为抗原,使T淋巴细胞致敏,与半抗原结合的动物自身细胞被破坏,从而导致肠道炎症的发生。炎症主要位于黏膜层,亦可累计黏膜下层,较少深达肌层。本实验中,分别运用肠涤清灌肠液灌肠、肠涤清灌肠液灌肠+肠炎清1号灌胃、SASP灌肠+灌胃法来治疗活动期实验性UC大鼠。治疗2周后,结果表明3种治疗方法皆可减轻CMDI,尤其以肠涤清+肠炎清组疗效最为明显(与其他3组比较,P值皆<0.01),在观察结肠黏膜病理形态学方面,运用药物干预治疗后,结肠黏膜炎症都有不同程度的减轻,溃疡变浅变小,炎症细胞减少,证明运用中药综合治疗UC疗效确实。
        至今为止,UC的病因及发病机制尚未完全明了。已有研究证实氧自由基与UC的结肠组织损伤密切相关,SOD活力下降,导致其清除氧自由基的能力下降,对细胞的保护减弱,同时MDA含量升高,脂质过氧化程度加强,进一步加剧对细胞的损伤程度,这是导致结肠炎症及溃疡形成的一个机制,因此本实验选择UC大鼠血清及结肠组织匀浆中SOD活力、MDA含量来评价药物治疗作用。研究发现,造模后模型组UC大鼠血清及结肠组织匀浆中,SOD活力明显下降(与正常组比较,P<0.01),MDA含量明显升高(与正常组比较,P<0.01),与相关报道的实验结果相一致[3,4]。通过药物干预治疗后,3个用药组中大鼠血清和结肠组织中SOD活力皆有不同程度的升高;MDA含量均有不同程度的下降,以肠涤清+肠炎清组SOD升高和MDA下降最为显著(与其他3组比较,P<0.05或P<0.01)。经过相关性分析发现,血清及结肠组织中SOD活力与CMDI呈负相关(P<0.01),MDA含量与CMDI呈正相关(P<0.01)。
        本研究结果提示,UC的发生发展与SOD和MDA异常有关,血清和结肠组织匀浆SOD活力及MDA含量的变化能反映结肠炎症的严重程度。肠涤清+肠炎清组可显著提高大鼠SOD活力、降低MDA含量,减轻结肠黏膜炎症,显示岀中药辨证论治、多途径、多靶点作用的优势。提高SOD活力及降低MDA含量是清热祛湿法治疗大肠湿热型UC的可能作用机制之一,其原理可能是清热祛湿中药能有效地清除氧自由基,从而抑制结肠组织中的脂质过氧化反应,并能稳定细胞膜,提高机体抗自由基损伤的能力,从而增强对细胞的保护作用,促进炎症和溃疡的愈合,可为临床治疗提供参考依据。由于本实验条件所限,并未复制出大肠湿热证模型,故动物实验并不能完全说明临床问题,在今后的研究中有待进一步探讨。
       【参考文献】
           [1]张涛,谢建群.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究[J]. 中国中西医结合消化杂志,2006,14(4):240.
       
       [2]Vilaseca J,Salas A,Guarner F,et al. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis [J]. Gut,1990,31(5):539.
       
       [3]马春曦,李志晋,詹丽英,等.溃疡性结肠炎大鼠肠组织中MDA、SOD、损伤指数的动态变化及其相关性研究[J].江西医学院学报,2005,45(3):4.
       
       [4]杨辉.热瘀散对溃疡性结肠炎胃肠湿热型大鼠模型MDA、SOD、IL-6的影响[J].广西中医药,2007,30(4):54.

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