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微波辅助提取野菊花中总黄酮的工艺研究
作者:张丽珍1,周之荣2*    
作者单位:(1.广东药学院附属门诊部, 广东 广州 510240; 2.广东药学院公共卫生学院, 广东 广州 510240)

《时珍国医国药》 2010年 第4期

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       【摘要】 
       目的对微波辅助提取野菊花总黄酮的工艺条件及参数进行优化。方法在单因素实验的基础上, 采用L9(34)正交设计, 以野菊花总黄酮的提取率为指标, 探讨料液比、微波辅助提取时间、乙醇浓度、微波功率对提取率的影响。结果最佳提取工艺参数为: 料液比1∶50,提取时间9 min,乙醇浓度(φ)=60 %,微波功率340 W。在上述最优条件下进行了精密度和回收率实验, 所得结果的相对标准偏差为1.9 % ( n =6) , 回收率在97.5 %~101.4 %之间。结论采用微波辅助提取野菊花总黄酮工艺简单可行, 为进一步的工艺开发提供了参考。
       【关键词】  野菊花; 总黄酮; 微波辅助提取; 正交实验
       野菊花是菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序。近年来研究表明,野菊花含有黄酮类物质。黄酮类化合物是自然界中广泛存在的一类天然产物,药理学研究表明其具有抗炎[1]、抗氧化[2,3]、抗过敏作用[4]以及降低血液和肝脏中胆固醇的作用[5]。提取黄酮的方法有:热水提取法、有机溶剂提取法、碱液提取法、超声波辅助提取法、超临界流体提取法、大孔树脂吸附法、酶法提取等[6]。但对野菊花总黄酮的微波辅助提取研究报道较少。
       微波提取技术利用微波能快速破坏细胞壁加快活性成分的溶出,而且使许多难溶物质在微波电磁场的作用下得到较好的溶解,从而提高了提取的速度和产率[7~10]。与常规方法比,微波提取具有选择性高、快速高效、溶剂消耗少、活性成分提取率较高、不产生噪音、适合于热不稳定物质的提取等特点[11,12]。
       为更有效地开发和利用野菊花药材资源,充分提取野菊花中所含的总黄酮成分,本文采用正交设计的方法进行了微波辅助提取工艺研究,以期改善传统的浸提方法,为进一步的开发利用提供参考。
       1 材料与仪器
       1.1 材料芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);野菊花(广州致信中药饮片有限公司)购自广东药学院附属门诊部药房;实验用水为双蒸水;所用试剂均分析纯。
       1.2 仪器MSP-100E 微波提取仪(北京雷明科技有限公司);U3010紫外可见分光光度计(日本日立公司);722型光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);HH-6电子恒温水浴锅(苏州威尔试验用品有限公司);FA2104电子分析天平(上海天平仪器厂)。
       2 方法与结果
       2.1 标准曲线的制备称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品0.200 0 g,置于100 ml 量瓶中,加乙醇70 ml,置于水浴上微热使溶解,冷却至室温,加甲醇至刻度,摇匀。精密吸取10 ml,置于100 ml 量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得0. 2 mg/ml 芦丁对照品溶液。精密量取对照品溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0 ml,分别置25 ml量瓶中,加乙醇至6 ml,加ρ(NaNO2)=5 %亚硝酸钠溶液1.0 ml,混匀,放置6 min,加ρ[Al(NO3)3]= 10 %硝酸铝溶液1.0 ml,摇匀,放置6 min,加ρ(NaOH)=5 %氢氧化钠试液10.0 ml,再加水至刻度,摇匀,放置15 min。以乙醇为参比,用1 cm比色皿,于U3010紫外可见分光光度计上,在400~600 nm 波长处进行扫描。结果表明,对照品溶液在510 nm 处有最大吸收,因此选择510 nm 作为测定波长。在510 nm 波长处测定体系的吸收度,以吸收度(A)为纵坐标、浓度ρ芦丁(μg/ml)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程A=0.0136 ρ芦丁+ 0.006 28 (r=0.999 4)。结果表明,芦丁对照品在所试浓度0.00~56.00 μg/ml范围内呈良好的线性关系。
       2.2 提取溶剂的选择
       2.2.1 水提取称取野菊花粉末1.000 0 g于特制的微波提取罐中,加水40 ml,浸泡30 min 后,控制一定压力,在微波功率255 W下提取9 min。趁热过滤至100 ml容量瓶中,药渣用少量水洗涤3次,每次过滤。并入滤液,冷却,用水定容后备用。
       2.2.2 乙醇提取称取菊花粉末1.000 0 g于特制的微波提取罐中,加φ=50 %乙醇40 ml,混匀,浸泡30 min 后,控制一定压力,在微波功率255 W下提取9 min。趁热过滤至100 ml容量瓶中。药渣用少量乙醇洗涤3次,每次过滤。并入滤液,冷却,用乙醇定容后备用。
       2.2.3 样品液总黄酮含量测定 移取样品液3.00 ml于25 ml容量瓶中,按标准曲线制备方法进行操作、显色,测定吸光度,由标准曲线得到样品中总黄酮含量。结果见表1。由表1可知,以乙醇作溶剂的提取法优于以水为溶剂的提取法。用水做溶剂提取黄酮虽然存在生产成本低,无溶剂残留的优点,但存在提取率较低,提取液存放易腐败变质,后续的过滤、浓缩操作困难且费时等不足,因此本实验选择乙醇作为提取溶剂。表1 提取溶剂与总黄酮产率的关系
       2.3 微波辅助提取单因素实验称取一定量的野菊花粉末,按照“2.2.2 ”项实验方法,采用单因数变换法分别试验料液比、微波辐射时间、乙醇浓度、微波辐射功率对野菊花总黄酮提取率的影响。
       2.3.1 料液比对野菊花总黄酮提取率的影响 以φ=50 %乙醇为提取溶剂,微波功率255 W,在微波辐射时间为9 min时,试验不同料液比对野菊花总黄酮提取率的影响。在料液比分别为1∶10~1∶80条件下进行提取,分别测定黄酮提取率。结果见图1。由图1可以看出,随着提取液用量的增加,野菊花总黄酮提取率增加。提取率增加可分为两个阶段:1∶10~1∶30为低产率阶段,提取率增幅较大;1∶40~1∶80为高产率阶段,到达1∶50时提取率基本上达到最高。当料液比超过1∶40后则提取率趋于平稳,提取率增幅很小。一般来说,料液比越大,提取率也越高。但料液比太大会给后处理工序增加困难,而且增加生产成本。在保证提取效果的同时,应尽量减少溶剂用量和降低蒸发浓缩负荷。综合经济效益和生产管理考虑,选择料液比为1∶40。
       图1 料液比对野菊花总黄酮提取率的影响
       2.3.2 微波辐射时间对野菊花总黄酮提取率的影响 在乙醇浓度为φ=50 %,料液比为1∶40,微波功率255 W时,试验不同微波辐射时间对野菊花总黄酮提取率的影响。当微波辐射时间为1~12 min时,分别测定总黄酮提取率。结果见图2。由图2看出,开始时随微波辐射时间的延长,野菊花总黄酮提取率增加,9 min时提取率最高;之后随微波辐射时间延长,总黄酮提取率呈下降趋势。可能由于微波辐射时间过长,使溶剂温度过高,破坏了野菊花提取物中的有效成分;也可能是高温使蛋白质凝固,造成黄酮不易溶出。选择微波辐射时间为9 min。
       图2 微波辐射时间对野菊花总黄酮提取率的影响
       2.3.3 乙醇浓度对野菊花总黄酮提取率的影响 在料液比1∶40,微波功率255 W,微波辐射时间为 9 min时,试验不同乙醇浓度对野菊花总黄酮提取率的影响。乙醇浓度(φ)在0 %~100 %范围内进行总黄酮提取,测定并计算总黄酮提取率。结果见图3。
       图3 乙醇浓度对野菊花总黄酮提取率的影响
       由图3看出,当乙醇浓度增大时,总黄酮提取率也随之提高,但乙醇浓度高于φ=60 %后,提取率有所下降。可能是由于高浓度乙醇使细胞内蛋白质凝固,影响总黄酮的溶出[13];同时因为黄酮糖苷是由两部分组成,苷元成分不易溶于水,而糖又易溶于水,因此在提取黄酮类化合物时,只有乙醇与水达到最佳比例时,提取率最高。而从提取液外观颜色看出,随着乙醇浓度增加(高于φ=80 %后),提取液颜色加深,说明有其它色素物质被提取出来,这对后续测定可能会产生影响,故选择φ=50 %乙醇为提取浓度。
       2.3.4 微波提取功率对野菊花总黄酮提取率的影响在乙醇浓度为φ=50 %,料液比1∶40,微波辐射时间为 9 min时,试验不同微波提取功率对野菊花总黄酮提取率的影响。微波提取功率在85~425 W范围内进行总黄酮提取,测定并计算总黄酮提取率。结果见图4。由图4看出,可知255 W 以前总黄酮提取率随功率增加呈现上升,255 W后开始下降。因此选择微波功率为255 W。
       图4 微波功率对野菊花总黄酮提取率的影响
       2.4 提取工艺参数的优化在单因素实验的基础上,结合药材性质以及实际生产要求,以乙醇浓度、料液比、微波提取功率、微波辐射时间为考察因素,以野菊花总黄酮的提取率为评价指标,采用正交实验探索最优化条件。因素水平见表2,正交实验结果见表3。
       由表3的分析可知,各因素对野菊花总黄酮提取率的影响程度不同,其影响的主次顺序为A>C>B>D,即料液比>乙醇浓度>微波辐射时间>微波提取功率。由数据可以得出:料液比为显著影响因素,正交分析最优组合应为A3B2C2D3(即料液比1∶50,微波辐射时间9 min,乙醇浓度φ=60 %,微波提取功率340 W)。表2 正交实验因素水平表3 总黄酮提取工艺正交实验[L9(34)]结果
       2.5 最佳条件下的重现性和回收率实验
       2.5.1 重复性实验取同一批取菊花样品6份,在最佳条件下进行提取,分别测定各自的总黄酮含量,结果表明其相对标准偏差为1.9%。
       2.5.2 加标回收率实验准确称取一定量取菊花样品3份,加入不同量的芦丁对照品溶液在最佳条件下进行提取,提取物按实验方法进行显色,测定吸光度,计算回收率,结果表明回收率在97.5%~101.4 %之间,说明方法有较好的准确度。
       3 讨论
       探讨了微波辅助提取野菊花总黄酮的工艺条件,实验结果优于目前大量采用的热水提取,克服了热水提取时溶剂消耗大,提取率低的缺点。
       由于芦丁和黄酮类化合物的基本母核结构均为2-苯基色原酮,具有相同的吸光度测试性质,于510 nm处有最大吸收峰,因而可以采用芦丁为对照品来测定野菊花中总黄酮的含量。微波辅助提取野菊花总黄酮的正交实验表明:因素料液比的影响最大,其次为乙醇浓度、微波辐射时间,微波提取功率的影响最小。通过正交实验结果以及最优参数的验证试验,最佳提取工艺条件为A3B2C2D3,即料液比1∶50,微波辐射时间9 min,乙醇浓度φ=60 %,微波提取功率340 W。在此条件下,进行了精密度和回收率实验, 所得结果的相对标准偏差为1.9 % ( n =6) , 回收率在97.5 %~101.4 %之间。本实验采用的微波辅助提取野菊花总黄酮技术是一种快速、简便、提取率高的提取方法。优选出的工艺操作简单、稳定性好。
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