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重组天花粉蛋白研究进展
作者:彭平平,黄利鸣,王艳林    
作者单位:三峡大学医学院,三峡大学分子生物学研究所,湖北 宜昌 443002

《时珍国医国药》 2010年 第5期

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       【摘要】 
       目的天然天花粉蛋白(TCS)是一种拥有抗肿瘤、抗病毒的核糖体失活蛋白,但在临床应用时有细胞毒性强和诱导严重过敏反应等不良反应。利用基因工程技术和化学修饰的方法对天然TCS进行改造和修饰,以期获得高效、低毒和低免疫原性的TCS供临床和研究使用,是当前研究的热点课题,文章综述了该领域的新近研究进展。
       【关键词】  天花粉蛋白; 定点突变; 化学修饰; 抗原性
       传统中草药天花粉,入药已有两千年历史,中医用于中期妊娠引产及宫外孕、葡萄胎、腹腔妊娠等疾病的治疗。天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是天花粉发挥药效的主要成分,Chow TP等[1]首先从括楼Trichosanthes kirilowii Maximovich叶片的基因组中分离到全长的TCS基因。序列分析结果显示,该基因没有内含子结构,成熟TCS由247个氨基酸组成,前体蛋白还包括一段信号肽(23个残基)和一段C末端肽序列(19个残基) [2]。近年来的临床研究发现,TCS对呼吸、消化、血液、生殖等多个系统的恶性肿瘤细胞均具有显著的生长抑制并诱导凋亡的作用[3~5],表现出广泛的抗病毒、抗肿瘤效应[6~8]。但由于TCS具有很强的免疫原性,可诱导产生破坏性抗体IgG和IgE [9],在临床试验中会也产生一些如过敏反应、神经和肾脏毒性等副作用 [10,11],从而限制了临床应用。
       随着分子克隆技术的发展,很多研究者致力于改变TCS结构,以达到降低免疫原性,提高药效,延长其体内代谢时间等为目的研究[2]。本文总结了近年来重组TCS及其生物学活性方面的相关研究进展。
       1  含有定点突变的重组TCS
       TCS是一种I型核糖体失活蛋白,具有N-糖苷酶活性,它能使28s rRNA第4324位点上的A脱腺嘌呤,由此导致核糖体失活并抑制蛋白质的生物合成。Wong KB等对TCS的酶活性中心处的Glu160和Glu189进行定点突变,并对突变后的重组TCS进行效价分析(体外蛋白合成抑制实验),结果发现,Glu160和Glu189上的羧基参与催化反应并对中间过渡复合体起到稳定作用。与野生型TCS相比,E160A(Glu-Ala突变)和E160D(Glu-Asp突变)分别使TCS的蛋白合成抑制效应减低15倍和52倍。E160A突变时,Glu189上的羧基可以替代Glu160的羧基发挥作用,但E160D突变时,Asp上的羧基偏离最佳催化位点,而Glu189上的羧基又无法补偿,因而后者能更大程度地影响TCS的活性。为证实活性位点处的羧基在介导酶催化活性中重要性,Wong等对Glu160和Glu189进行E160A/E189A双突变, 结果TCS对蛋白合成的抑制效应下降了1800倍。与天然TCS相比,E160D、E160A突变蛋白的抗增殖、免疫抑制能力也都显著降低,这些结果得到Ng TB等实验的进一步证实,并发现重组TCS对体外培养胚胎细胞的毒性较其他细胞(脾细胞和肿瘤细胞)要高。
       随后徐琼芳等利用DNA聚合酶链式反应(PCR)技术,将天然天花粉蛋白(nTCS)基因中22位精氨酸(Arg)定点突变为亮氨酸(leu),突变后的天花粉蛋白R22LTCS其核糖体抑制功能降低了10%。从TCS的晶体结构分析,TCS中Arg22与Ala161和Ala162之间形成两个H键, Arg22突变为Leu22后,上述氢键将消失,由此影响临近的酶活性位点(Glu160-Arg163)的构象。姚宏兵则将TCS基因的两个保守残基14位酪氨酸(Tyr)和22位精氨酸(Arg)同时定点突变为苯丙氨酸(Phe)和亮氨酸(leu), 得到的重组蛋白Y14F/R22LTCS对核糖体活性的抑制能力比天然TCS降低了7.5倍,活性变化不显著,说明TCS的Try14和Arg22对维持其活性部位构象并不是必需的。但由于Y14F/R22L TCS在大肠杆菌E.coli中的表达量与天然TCS相比明显下降,因此,Tyr14和Arg22可能与TCS翻译后的折叠有关。
       Chan SH[12]等认为,成熟TCS的 C末端可能与该蛋白的抗原性有关,他们通过系列删除的方法逐步去掉成熟TCS C末端的氨基酸残基,结果发现C末端系列对维持TCS的正常构象极为重要,为保持TCS的基本生物活性,C末端能够被删除的氨基酸数最多只能是7个。这种C末端移除7个氨基酸的突变TCS(C7-TCS)其体内抗原活性降低2.7倍、细胞毒性则下降10倍。他们对C7-TCS的结构进行分析发现,与野生型TCS相比,突变导致蛋白螺旋程度降低,色氨酸192(Trp192)暴露和热稳定性下降。这些构象上的改变是否是其免疫原性下降的分子基础有待进一步深入探讨。
       近来,王萍等[13]通过RT-PCR技术扩增无N端信号肽和C端肽序列的TCS基因,成功构建了原核高效表达质粒pET-29b-TCS并获得重组蛋白。他们发现与TCS前体蛋白相比,重组蛋白的抗原性显著降低。聂慧玲将天花粉蛋白分子上第120~123位的氨基酸残基从Lys-Ile-Arg-Glu突变为Ser-Ala-Gly-Gly,结果突变体TCS抑制蛋白质合成的能力(ID50)降低了约4 000倍,而用中期妊娠小鼠的流产试验证实,突变体TCS对胎鼠致死效力仅约为天然TCS的8%;当对第98和177位的氨基酸作Asp-Gly和Lys-Arg突变后,所得突变体蛋白的生物活性均未见明显改变,上述结果提示120~123位氨基酸对TCS发挥生物学活性有重要意义。安群星等[14]对TCS分子上可能的抗原决定簇位点(Tyr-Phe-Phe81-83、Lys-Arg173-174)进行定点突变,得到突变体TCS(Ala-Cys- Ser81-83,Cys-Gly173-174),并将新的突变体与野生TCS(wTCS)进行各种生物活性及免疫原性分析,发现突变TCS在DNA酶活性、致核糖体失活活性方面与wTCS没有统计学差异,突变TCS免疫的小鼠其血清内IgE水平显著降低, 说明突变体TCS免疫原性较wTCS低。
       最近,尤程程等[15]用RT-PCR技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCS cDNA,测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+)并转化入BL21(DE3)细胞。IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化得到重组天花粉蛋白(rTCS),rTCS碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源。随后对比分析了rTCS和wTCS对宫颈癌Hela细胞生长的影响,结果表明,二者对Hela细胞的抑制均随药物浓度的增加而加强, rTCS的IC50小于wTCS, 表明rTCS的细胞毒性小于wTCS。
       2  化学修饰的TCS
       2.1  聚乙二醇(PEG)修饰PEG是一种安全无毒、无活性、溶解性好的大分子聚合物,由氧乙烯单体聚合而成,常用于蛋白、多肽类及非肽类药物的化学修饰[16]。PEG对巯基(半胱氨酸Cys侧链上的基团) 的修饰具有很高特异性,但TCS本身不含Cys残基,为获得PEG修饰的TCS,姜国勇等首先通过定点突变将一个Cys残基引入到TCS中,然后再将 PEG耦联到新引入的 Cys侧链上。先前何贤辉等[17]通过基因克隆,用半胱氨酸(Cys)残基取代第7位的丝氨酸(Ser),以此作为TCS碱基序列上唯一一个Cys与PEG耦联,从而得到分子量为38 KD的PEG-TCS复合物。PEG修饰使其蛋白合成抑制活性相对于天然天花粉蛋白降低约6倍,但其引产活性(体内)并无明显改变,与wTCS基本相同。An QX等[18]将TCS 81-83位Tyr-Phe-Phe突变成Ala-Cys-Ser,得到的突变重组体蛋白再用PEG修饰。随后的研究发现,PEG修饰后的TCS DNA酶活性与野生天花粉蛋白(wTCS)相同,核糖体失活活性是wTCS的1/9-1/8;PEG修饰TCS免疫小鼠后, 血清IgE和IgG滴度显著低于用wTCS免疫的小鼠,值得注意的是,PEG修饰后的重组TCS在体内平均留存时间和半衰期显著升高,而血浆清除率极大地降低。而在第173位引入的半胱氨酸残基进行PEG定点修饰,修饰后TCS的活性与野生型TCS(wTCS)活性几乎相当,而免疫原性已显著降低,PEG修饰型TCS虽有活性下降,但其免疫原性、急性毒性以及药代动力学性质得到显著提升[19]。
       2.2  葡聚糖修饰  陈华伦等[20]还通过定点突变,用Cys分别替代Arg29和Lys173后,再将葡聚糖耦联到Cys上。与wTCS相比,修饰蛋白TCS(R29C)和TCS(K173C)的核糖体抑制蛋白活性降低50%,平均存留时间增加27倍。葡聚糖修饰的TCS(K173C)在猪体内引发的过敏反应大大降低。同wTCS相比,葡聚糖修饰的TCS(K173C)对lgG和IgE的反应降低,相反葡聚糖修饰的TCS(R29C)的免疫原活性没有明显改变。这些结果提示Lys173位于或接近抗原决定区域。
       3  重组天花粉蛋白突变体质量标准建立
       HAN Chun-mei等[21]建立了一套对重组天花粉蛋白突变体(MTCS)的质量控制标准和检测方法。这些检测方法包括用HL-60细胞株/MTT比色法定量测定MTCS体外生物学活性;用C4-HPLC和非还原型SDS-PAGE测定蛋白纯度;用毛细管电泳法测定等电点;用胰酶消化/RP-HPLC测定肽图;用还原型SDS-PAGE测定蛋白分子量等。用这些方法检测实验样品时,MTCS原液和成品对HL-60细胞的反应曲线与参考品的反应曲线一致,都呈现典型的S型曲线并且符合四参数方程式Y=[(A-D)/(1+(X/C)^B)]+D,相关系数大于0.99;蛋白质纯度大于95.0%;等电点为9.16;蛋白原液的肽图与参考品肽图图形一致,分子量为2.72x10^4。上述质量控制标准和检测方法的建立,对推动基因重组TCS的研究具有非常重要的意义。
       综上所述,天然天花分蛋白经过定点突变和化学修饰后,突变体的核糖体失活活性,体内外细胞毒性,胚胎毒性,抗原性,血浆清除率都有很大的改变。该领域的研究成果,为研制低毒、高效和低免疫原性的TCS提供了新的思路和技术手段,具有重要的临床意义。
       【参考文献】
           [1]Chow TP, Feldman RA, Lovett M,et al. Isolation and DNA sequence of a gene encoding alpha-trichosanthin, a type I ribosome- inactivating protein[J].J Biol Chem,1990,265(15):8670.
       
       [2]Shaw PC, Lee KM, Wong KB. Recent advances in trichosanthin, a ribosome-inactivating protein with multiple pharmacological properties[J].Toxicon,2005,45:683.
       
       [3]Jun Xu,De Fu Gao,Guo Li Yan,et al. Induced apoptotic action of recombinant trichosanthin in human stomach adenocarcinoma MCG803 cells[J].Mol Biol Rep.2009,36(6):1559.
       
       [4]LU Hongbin,TENG Rong,CHEN Ping.Induction of Apoptosis in HL-60 Cells by trichosanthin in Vitro[J].Med Jof Communications,2008,22(4):359.
       
       [5]Huang YL, Huang LM, Shi XL, et al. The effect of trichosanthin on Hela cell"s proliferation and apoptosis[J].Chin Pharmacol Bull 2005,21:253.
       
       [6]CHEN Guang-fu,YIN Fei,ZHANG Hong-yuan, et al. Inhibitive effects of trichosanthin on herpes simplex virus-1 in vivo and vitro[J].China Journal of Modern Medicine, 2008, 18 :19.
       
       [7]丁波泥,陈道瑾,李小荣,等. 天花粉蛋白抑制乳腺癌生长的实验研究[J].实用肿瘤杂志,2008, 23( 4):310.
       
       [8]Kunzhong Zhang,Jianhua Xu,Xiuwang Huang, et al.Trichosanthin down-regulated p210 and enhaced imatinib-induced growth arrest in chronic myelogenous leukemia cell line K562[J].Cancer Chemother Pharmacol,2007, 60:581.
       
       [9]Cai X,Yao G,Xu G,et al. Idification of the amino acid residues in trichosanthin crucial for IgE response[J].Biochem BioPhys Res Commun, 2002,297(3):510.
       
       [10]Shen WZ, Sha O, Yew DT, et al.Retrograde transport of a traditional Chinese medicine, alpha-trichosanthin, and its selective neural toxicity[J].Clin Toxicol (Phila), 2009, 9(24):23.
       
       [11]Chan WL, Zheng YT, Huang H, et al. Relationship between tri-chosanthin cytotoxicity and its intracellular concentration[J].Toxicology,2002,177:245.
       
       [12]Chan SH, Shaw PC, Mulot SF, et al. Engineering of a mini-trichosanthin that has lower antigenicity by deleting its C-terminal amino acid residues[J].Biochem Biophys Res Commun, 2000, 270(1):279.
       
       [13]王 萍,丁世萍,李继承. 重组天花粉蛋白的原核表达纯化和免疫原性分析[J].解剖学报, 2006, 37(2):172.
       
       [14]安群星,贾 宁,张献清,等. 突变前后天花粉蛋白的生物活性及免疫原性比较研究[J]. 西北国防医学杂志, 2008,29(4):254.
       
       [15]尤程程,黄利鸣,王艳林,等.重组天花粉蛋白的原核表达、纯化及其对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响[J].肿瘤防治研究,2009,36(3):190.
       
       [16]Veronese, F.M., Pasut, et al. PEGylation, successful approach to drug delivery[J].Drug Discov. Today 2005,10:1451.
       
       [17]何贤辉,聂慧玲,邵鹏柱,等.天花粉蛋白的定点聚乙二醇修饰[J].中国生物化学与分子生物学报, 1999, 15(6):924.
       
       [18]An QX, Lei YF, Mu SJ, et al. A comparative study on the properties of trichosanthin before and after site-directed PEGylation[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2008, 88(20):1433.
       
       [19]AN Qun-Xing,LEI Ying-Feng, YANG Jing,et al. Primary Studies on the Properties of Trichosanthin After Site-directed Mutagenesis and PEGylation[J].Chemical Journal of Chinese Universities,2009,30(8):1586.
       
       [20]陈华伦,李晓兵,徐琼芳,等. 定点偶联葡聚糖降低天花粉蛋白的免疫原活性[J].云南大学学报(自然科学版), 1999,21(S3):197.
       
       [21]HAN Chun-mei,YUAN Li-yong,RAO Chun-ming,et al. Study of the requirements and methods for quality control of recombinant mutant trichosanthin[J].Chin J Pharm Anal,2006,26(9):1225.

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