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黄连须根总生物碱及单体的联产工艺研究
作者:柳 明1,叶小利2,梁艳婷1,王 亮1,蓝 萍1 ,陈 新1,黄文文1,李学刚1*    
作者单位:(1.西南大学 药学院,重庆 400716 ; 2.西南大学 生命科学学院,重庆 400715)

《时珍国医国药》 2010年 第7期

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       【摘要】 
       目的研究从黄连须根中分离纯化黄连生物碱单体和总碱的联产工艺。方法用0.3%硫酸水加热回流提取黄连须中总生物碱,用石灰乳调节提取液pH为5~6,过滤;滤液用JG-101树脂吸附,用不同洗脱剂分步洗脱;重结晶获得药根碱和小檗碱单体,盐析获得黄连总生物碱;用HPLC分析黄连生物碱及总碱含量。结果用2%氢氧化钠洗脱,酸中和后重结晶得药根碱单体;再用70%酸性甲醇(1% H2SO4)溶液洗脱总生物碱;洗脱液中加入2%NaCl沉淀并重结晶得小糪碱单体;上清液加20%NaCl沉淀获得余下总生物碱。结论用JG-101树脂能够很好吸附黄连总生物碱,药根碱和小檗碱单体的纯度均达到95%以上,总生物碱(小檗碱、黄连碱、巴马汀和药根碱之和)的含量为90%左右。
       【关键词】  黄连; 须根; 总生物碱; 生物碱单体; 联产工艺; 树脂
       Technology for Joint Producing Total and Monomeric Alkaloids from Fibrous Root of Coptis chinensis Franch.
       LIU Ming1 ,YE Xiaoli2, LIANG Yanting1,WANG Liang1,LAN Ping1, CHEN Xin1,HUANG Wenwen1,LI Xuegang1*
       (1. College of Pharmacological Science, Southwest University, Chongqing 400716, China;2.School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the joint producing technology by isolating and purifying the total alkaloids and monomeric alkaloids from the fibrous root of Coptis chinensis Franch. MethodsThe extract of total alkaloids was obtained from the fibrous root of Coptis chinensis Franch with 0.3% H2SO4 by heating reflux and precipitated by adjusting pH to 5~6 with lime. After filtration, the filtrate was absorbed with JG-101 resin and eluted with different eluant. Subsequently, jatrorrhizine and berberine were obtained by recrystallized, and total alkaloids by salting out. The content of alkaloids was analyzed by HPLC.ResultsJatrorrhizine faction was eluted with 2% NaOH, neutralized with HCl, fruther recrystallized in distilled water to obtain jatrorrhizine monomer. Total alkaloids were eluted with 70% acidic methanol (containing 10% H2SO4), from which berberine was obtained by 2% NaCl precipitation and recrystallization. Supernatant was treated with the mixture of 20% NaCl to collect the residual total alkaloids. ConclusionJG-101 resin has a strong absorption capability to total alkaloids. The purity of jatrorrhizine and berberine can be up to 95%, and that of total alkaloids(berberine, coptisine, palmatine and jateorrhizine)is about 90%.
       Key words:Coptis chinensis Franch; Fibrous root; Total alkaloids; Alkaloid monomer; Joint producing technology; Resin
       黄连是毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的根茎,味苦、性寒,入心、肝、胃、大肠经,有清热燥湿,泻火解毒的功能,《神农本草经》将其列为上品;主要成分为小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱、巴马亭汀、药根碱、表小檗碱、木兰花碱等生物碱,总生物碱含量高达10%以上[1]。研究发现,味连含小檗碱约占黄连总生物碱的50%左右,而小檗碱、巴马汀、黄连碱、药根碱等4个生物碱之和占黄连总生物碱含量的90%左右,基本上可以代表黄连“总生物碱”[2]。黄连生物碱的临床作用越来越广泛地被开发利用,近年还发现小糪碱有显著的降糖和调脂功效[3],药根碱被发现具有很好的降血糖作用[4]。最近的研究结果表明,黄连须根含3%的生物碱[5]。由于黄连须根为废弃资源,以黄连须根为原料替代黄连提取黄连生物碱,不仅可以大幅度地降低成本,而且可以更加合理和充分地利用中药资源,提高黄连资源的利用率。目前还未见有关黄连须根生物碱分离提取及联产技术方面的研究报道。
       本文首次以废弃的黄连须根为原料,采用溶剂提取、树脂分步分离、沉淀和重结晶等方法,从中分离提取小檗碱、药根碱单体及总生物碱,研究黄连须根生物碱的联产工艺,为黄连综合利用开发开辟新途径和提供新的理论依据。
       1 材料
       1.1 仪器LC-6AD高效液相色谱仪(日本岛津),旋转蒸发仪(上海亚荣生化分析仪厂),KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司),TG16-W微量高速离心机(长沙相仪离心机仪器有限公司)。
       1.2 材料与试剂黄连须采自于重庆石柱县,经重庆市中药研究院瞿显友研究员鉴定为味连品种,对照品药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱(成都曼思特生物科技有限公司),纯度≥98%;乙腈(色谱纯),磷酸二氢钾及其它试剂均为分析纯。
       2 方法
       2.1 对照品溶液的制备分别精密称取盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各10 mg,置于10 ml容量瓶中,用分析纯甲醇稀释定容,超声溶解后制成盐酸药根碱10 μg·ml-1,盐酸黄连碱10 μg·ml-1,盐酸巴马汀10 μg·ml-1,盐酸小檗碱10 μg·ml-1的对照品混合溶液。
       2.2 色谱条件Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:乙腈-0.1 mol·L-1的磷酸二氢钾水溶液(38∶62),流速1 ml·min-1,柱温30 ℃,进样量20 μl,检测波长345 nm。
       2.3 黄连须生物碱提取方法[6]用5倍体积0.3%硫酸水溶液浸泡黄连须2 h,加热回流提取3次,时间为1,1 ,0.5 h。合并3次提取液,适当浓缩后加入石灰乳中和[7]溶液pH为5~6,过滤,滤液用于下述实验研究。取滤液用甲醇稀释100倍后,用HPLC检测含量。
       2.4 树脂吸附和洗脱试验于5个200 ml锥形瓶中分别取预处理后的溶液100 ml,加入预处理好的D101,732,D152,AB-8,JG101树脂各5 g,振荡吸附60 min,取上清液稀释100倍后,测定生物碱含量。
       将732和JG101树脂过滤,水洗树脂1次。再将树脂分为3份,每份1 g,分别加入10 ml甲醇、2%硫酸和2%的氢氧化钠,振荡洗脱1 h。上清液稀释100倍后,测定生物碱含量。
       2.4.1 pH对JG-101树脂吸附量的影响取100 ml滤液共7份,分别用硫酸和氢氧化钠调节溶液的pH值为4,5,6,7,8,9,10,然后在每份中加入5 g预处理好的JG-101树脂进行吸附试验,振荡吸附60 min,取上清液测定生物碱含量。
       2.4.2 碱溶液洗脱药根碱单体取吸附黄连生物碱饱和的树脂5 g,分别放于5个烧杯中,添加不同浓度氢氧化钠溶液,振荡洗脱30 min。过滤,滤液稀释100倍,用HPLC测定生物碱含量。
       2.4.3 不同浓度的硫酸甲醇溶液洗脱总生物碱分别取5 g吸附饱和的JG-101树脂,每份用50 ml硫酸含量分别为0.25%,0.5%,1.0%,2%,3%的甲醇溶液(甲醇浓度为70%)进行洗脱,振荡吸附60 min,最后过滤取样分析溶液中生物碱浓度。
       2.5 JG-101树脂分离纯化黄连生物碱
       2.5.1 溶液上柱取200 ml预处理好的树脂,装于250 ml分离柱中,水洗平衡后。将预处理好的溶液调节pH=6.0,然后按照2%的速度(4 ml·min-1)上柱,直到从树脂柱中流出的穿漏液出现黄色(黄连生物碱出现),停止上柱,然后,水洗到中性。
       2.5.2 药根碱的制备再用1%的氢氧化钠溶液洗脱,收集药根碱组分;减压浓缩后,加入10%的氯化钠,放置过夜;过滤,收集沉淀。沉淀溶于适量热水,然后冷却结晶,得到药根碱单体。
       2.5.3 小檗碱制备氢氧化钠洗脱完成后,水洗到中性;然后,用70%的酸性甲醇(含硫酸1%)洗脱。洗脱液减压浓缩回收甲醇。取浓缩液分为7份,每份1 ml,分别加入不同浓度的氯化钠,沉淀24 h;取上清液分析生物碱含量。
       其余的浓缩液中加入2%的氯化钠,放置沉淀24 h,过滤,沉淀用水溶于热水中,冷却结晶1次,得到小檗碱单体。
       2.5.4 黄连总生物碱的制备沉淀小檗碱后的一次母液,加入20%的氯化钠,放置24 h后,过滤;沉淀用适量蒸馏水洗涤1次,得到黄连总生物碱。
       3 结果与讨论
       3.1 吸附剂的选择D101,732,D152,AB-8,JG-101等5种树脂对黄连生物碱的吸附结果见图1。从图1中可以看到,用732和JG-101树脂吸附黄连生物碱提取液后,母液中余下的黄连生物碱的量大幅度减少,说明732和JG-101树脂对黄连生物碱的吸附能力最强。图1 经过树脂吸附后的母 图2 提取液pH变化对JG-101液中剩余生物碱浓度 树脂吸附生物碱的影响
       用不同溶剂洗脱吸附了黄连生物碱的732和JG-101树脂,然后用HPLC检测洗脱液中黄连生物碱的含量。结果见表1表1 洗脱液中黄连生物碱的含量mg·ml-1
       3.2 溶液pH值对吸附量的影响溶液的pH值变化对JG-101树脂吸附黄连生物碱的影响结果见图2 从图2中可以看到,随着溶液的pH增加,溶液中余下的生物碱量逐步减少,当溶液的pH为6.0时,溶液中余下的生物碱最少,随后溶液中余下的生物碱浓度增加,说明在溶液的pH为6.0时,JG-101树脂的吸附效果最好。
       3.3 氢氧化钠洗脱药根碱的结果JG-101树脂吸附生物碱后,用不同浓度的氢氧化钠洗脱树脂上的药根碱。结果见图3。随着氢氧化钠浓度增加,洗脱药根碱的效果增加,但是当氢氧化钠的浓度高于2%以后,其他生物碱也被洗脱下来。用2%的氢氧化钠,洗脱的生物碱主要是药根碱,其他生物碱洗脱下来较少。因此,洗脱药根碱时,氢氧化钠溶液的浓度应该控制在2%以下图3 不同浓度NaOH对JG-101 图4 药根碱结构树脂的解吸作用黄连生物碱中,药根碱是唯一的一个带“酚羟基”的生物碱(见图4),具有一定的酸性,在碱性条件下容易电离并带负电荷,大幅度增加药根碱的水溶性;而其他生物碱在碱性条件下不会电离,这可能是碱溶液可以洗脱药根碱的原因。
       3.4 酸性甲醇溶液洗脱黄连生物碱的结果JG-101树脂吸附生物碱后,用不同酸浓度的酸性甲醇(70%)洗脱黄连生物碱的结果见图5。结果表明,用1%的酸性甲醇溶液洗脱黄连生物碱的效果已经较好了。JG-101树脂是一种弱酸性阳离子交换树脂,强酸的质子与酸性基团具有较强的交换能力,从而使生物碱解析;同时,黄连生物碱为季铵型生物碱,其所带电荷不随溶液的pH变化而变化,同时,黄连生物碱在甲醇溶液中的溶解性较好,因此,用一定浓度的酸性甲醇可以将黄连生物碱洗脱下来。图5 不同浓度H2SO4浓度的(70%)甲醇溶剂对JG-101树脂解吸作用
       3.5 不同浓度的氯化钠沉淀黄连生物碱的结果表2列出了不同浓度的NaCl对黄连生物碱沉淀效果的影响。随着NaCl浓度增加,母液中残留的各种生物碱的含量在不同程度上减少。当NaCl浓度低于2%时,母液中小檗碱的含量大幅度下降,而其它3种生物碱的含量与对照基本相同。说明当氯化钠的浓度低于2%时,沉淀的主要是小檗碱。但当NaCl浓度继续增加(大于3%),母液中药根碱、黄连碱及巴马汀的含量开始下降,说明当氯化钠的浓度高于2%以后,黄连碱、巴马汀、小檗碱均一起沉淀。
       表2 不同浓度的NaCl%(g/v)对黄连生物碱沉淀效果的影响氯化钠(%)
       3.6 黄连须根提取黄连总生物碱和联产药根碱和小檗碱单体实验结果按照“2.5”项的试验流程生产的药根碱、小檗碱和黄连总生物碱的含量分析结果见表3表3 黄连总生物碱和单体纯度分析%
       4 结论
       用JG-101树脂能够很好地吸附黄连生物碱,吸附后用氢氧化钠可以洗脱被JG-101树脂吸附的药根碱,用酸性甲醇可以洗脱吸附的所有黄连生物碱。以黄连须根为原料,提取药根碱、小檗碱和黄连总生物碱的最佳工艺技术为:0.3%的硫酸溶液提取3次,提取液适当浓缩后中和到溶液的pH=6.0左右;上清液用JG-101树脂吸附,然后水洗,再用1%的氢氧化钠溶液洗脱药根碱;水洗后,再用1%的硫酸甲醇溶液(70%甲醇)洗脱总生物碱;回收甲醇后,用2%的氯化钠沉淀总生物碱中的小檗碱;最后用20%的氯化钠沉淀黄连总生物碱。在最佳条件下,药根碱和小檗碱重结晶一次,可以得到纯度为97%的药根碱、98%的小檗碱和含量92%的黄连总生物碱。
       以废弃资源黄连须为原料,通过本实验将黄连须中所含的黄连生物碱进行了提取分离。得到了小檗碱和药根碱单体,有关单体经过一次重结晶,纯度即可达到95%以上;同时得到黄连总生物碱,小檗碱、巴马汀、药根碱和黄连碱4个生物碱的总含量为90%左右,可以满足不同领域的需求。本工艺技术得到的产品纯度高,成本低廉,加工过程简单,易于制备,适合大规模工业化生产,具有广阔的前景。
       【参考文献】
          [1] 李 备, 刘华蓉, 潘永全, 等. 黄连总生物碱对乙醇致大鼠胃黏膜损伤的保护作用及其机制探讨[J].中国中药杂志,2006,31(1):51.
       
       [3] 钟国跃, 黄小平, 马开森, 等. 我国黄连(味连) 质量评价研究[J].中国中药杂志,2005,30(7):594.
       
       [3] Kong WJ, Wei J, Abidi P, et al. Berberine is a novel cholesterol-lowering drugworking through a unique mechanism distinct from statins[J].Nat Med, 2004, 10(12):1344.
       
       [4] Lee YS , Kim WS , Kim KH , et al.Berberine, a natural plant product, activates AMP - activated protein kinase with beneficial metabolic effects in diabetic and insulin - resistant states[J].Diabetes, 2006, 55:2256.
       
       [5] 冯 敏,黄 明, 李学刚, 等. 味连及其副产物有效成分和氨基酸含量的研究[J].中药材, 2005,28(9):753.
       
       [6] 周家洲.黄连须根有效成分提取工艺研究[J].中外医疗,2008,27(29):69.
       
       [7] 许沛虎,高 媛 ,张雪琼,等.黄连总生物碱纯化工艺研究[J]. 时珍国医国药,2007,18(12):3080.

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